Universāls SYBR GREEN qPCR premikss (zils)
Kaķa Nr.: HCB5041B
Universal Blue qPCR Master Mix (Dye Based) ir 2x reāllaika kvantitatīvās PCR pastiprināšanas iepriekšējais risinājums, kam raksturīga augsta jutība un specifiskums, zilā krāsā un parauga pievienošanas izsekošanas efekts.Galvenā sastāvdaļa Taq DNS polimerāze izmanto antivielu karsto palaišanu, lai efektīvi kavētu nespecifisku amplifikāciju, ko izraisa praimera atkausēšana parauga sagatavošanas laikā.Tajā pašā laikā formula pievieno veicinošos faktorus, lai uzlabotu PCR reakcijas amplifikācijas efektivitāti un izlīdzinātu gēnu amplifikāciju ar dažādu GC saturu (30 ~ 70%), lai kvantitatīvā PCR varētu iegūt labu lineāru attiecību plašā kvantitatīvā. novads.Šis produkts satur īpašu ROX Passive Reference Dye, kas ir piemērojama lielākajai daļai qPCR instrumentu.Nav nepieciešams pielāgot ROX koncentrāciju dažādiem instrumentiem.Lai sagatavotu reakcijas sistēmu amplifikācijai, ir nepieciešams tikai pievienot praimerus un veidnes.
Sastāvdaļas
Universāls zils qPCR Master Mix
Uzglabāšanas apstākļi
Produkts tiek piegādāts kopā ar ledus iepakojumiem, un to var uzglabāt -25 ℃ ~ -15 ℃ 18 mēnešus.Uzglabājot vai sagatavojot reakcijas sistēmu, ir jāizvairās no spēcīgas gaismas apstarošanas.
Specifikācija
| Koncentrēšanās | 2× |
| Atklāšanas metode | SYBR |
| PCR metode | qPCR |
| Polimerāze | Taq DNS polimerāze |
| Parauga veids | DNS |
| Uzklāšanas aprīkojums | Lielākā daļa qPCR instrumentu |
| Produkta veids | SYBR premikss reāllaika fluorescences kvantitatīvai PCR |
| Pieteikties (pieteikums) | Gēnu ekspresija |
Instrukcijas
1.Reakcijas sistēma
| Sastāvdaļas | Tilpums (μL) | Tilpums (μL) | Galīgā koncentrācija |
| Universāls SYBR GREEN qPCR premikss | 25 | 10 | 1× |
| Forward Primer (10 μmol/L) | 1 | 0.4 | 0,2 μmol/L |
| Reversais gruntējums (10 μmol/L) | 1 | 0.4 | 0,2 μmol/L |
| DNS | X | X | |
| ddH2O | līdz 50 | līdz 20 | - |
[Piezīme]: Pirms lietošanas rūpīgi samaisiet, lai izvairītos no pārmērīgu burbuļu rašanās no spēcīgas kratīšanas.
a) Primer koncentrācija: galīgā praimera koncentrācija ir 0,2 μmol/L, un to var arī attiecīgi pielāgot robežās no 0,1 līdz 1,0 μmol/L.
b) Šablona koncentrācija: ja veidne ir neatšķaidīts cDNS izejas šķīdums, izmantotais tilpums nedrīkst pārsniegt 1/10 no kopējā qPCR reakcijas tilpuma.
c) Veidnes atšķaidīšana: cDNS izejas šķīdumu ieteicams atšķaidīt 5-10 reizes.Optimālais pievienotās šablona daudzums ir labāks, ja pastiprināšanas rezultātā iegūtā Ct vērtība ir 20-30 cikli.
d) Reakcijas sistēma: lai nodrošinātu mērķa gēna amplifikācijas efektivitāti un atkārtojamību, ieteicams izmantot 20 μL vai 50 μL.
e) Sistēmas sagatavošana: lūdzu, sagatavojieties īpaši tīrā stendā un izmantojiet uzgaļus un reakcijas caurules bez nukleāzes atlikumiem;uzgaļus ieteicams izmantot ar filtru kasetnēm.Izvairieties no savstarpējas piesārņošanas un aerosola piesārņojuma.
2.Reakcijas programma
Standarta programma
| Cikla solis | Temp. | Laiks | Cikli |
| Sākotnējā denaturācija | 95℃ | 2 min | 1 |
| Denaturācija | 95℃ | 10 sek | 40 |
| Atkausēšana/pagarināšana | 60℃ | 30 sek★ | |
| Kušanas līknes stadija | Instrumenta noklusējuma iestatījumi | 1 | |
Ātrā programma
| Cikla solis | Temp. | Laiks | Cikli |
| Sākotnējā denaturācija | 95℃ | 30 sek | 1 |
| Denaturācija | 95℃ | 3 sek | 40 |
| Atkausēšana/pagarināšana | 60℃ | 20 sek★ | |
| Kušanas līknes stadija | Instrumenta noklusējuma iestatījumi | 1 | |
[Piezīme]: Ātrā programma ir piemērota lielākajai daļai gēnu, un standarta programmas var izmēģināt atsevišķiem sarežģītas sekundārās struktūras gēniem.
a) Atlaidināšanas temperatūra un laiks: lūdzu, pielāgojiet to atbilstoši praimera un mērķa gēna garumam.
b) Fluorescences signāla iegūšana (★): lūdzu, iestatiet eksperimentālo procedūru atbilstoši instrumenta lietošanas instrukcijā noteiktajām prasībām.
c) Kušanas līkne: instrumenta noklusējuma programmu var izmantot normāli.
3. Rezultātu analīze
Kvantitatīviem eksperimentiem bija nepieciešami vismaz trīs bioloģiskie atkārtojumi.Pēc reakcijas ir jāapstiprina pastiprināšanas līkne un kušanas līkne.
3.1. Pastiprināšanas līkne:
Standarta pastiprināšanas līkne ir S-veida.Kvantitatīvā analīze ir visprecīzākā, ja Ct vērtība ir no 20 līdz 30. Ja Ct vērtība ir mazāka par 10, ir nepieciešams atšķaidīt šablonu un veikt testu vēlreiz.Kad Ct vērtība ir no 30 līdz 35, ir jāpalielina šablona koncentrācija vai reakcijas sistēmas tilpums, lai uzlabotu pastiprināšanas efektivitāti un nodrošinātu rezultātu analīzes precizitāti.Ja Ct vērtība ir lielāka par 35, testa rezultāti nevar kvantitatīvi analizēt gēna ekspresiju, bet tos var izmantot kvalitatīvai analīzei.
3.2. Kušanas līkne:
Atsevišķs kušanas līknes maksimums norāda, ka reakcijas specifika ir laba un var veikt kvantitatīvo analīzi;ja kušanas līknē ir dubulti vai vairāki maksimumi, kvantitatīvo analīzi nevar veikt.Kušanas līknē ir redzami dubultie maksimumi, un ir nepieciešams spriest, vai nemērķa maksimums ir primera dimērs vai nespecifiska amplifikācija ar DNS agarozes gēla elektroforēzi.Ja tas ir grunts dimērs, ieteicams samazināt primer koncentrāciju vai pārveidot primerus ar augstu pastiprināšanas efektivitāti.Ja tā ir nespecifiska pastiprināšana, lūdzu, palieliniet atkausēšanas temperatūru vai pārveidojiet primerus ar specifiskumu.
Piezīmes
Lūdzu, valkājiet nepieciešamos IAL, piemēram, laboratorijas mēteli un cimdus, lai nodrošinātu savu veselību un drošību!
Šis produkts ir paredzēts TIKAI pētniecībai!
