Augu tiešā PCR komplekts
Kaķa Nr.: HCR2020A
Plant Direct PCR komplekts ir piemērots tiešai augu lapu, sēklu u.c. pastiprināšanai, un to var izmantot augu paraugu augstas caurlaidības skrīningam, kas nesatur polisaharīdus un polifenolus.Tiešās amplifikācijas DNS polimerāzei, kuras pamatā ir virzīta evolūcija, ir labāka tolerance pret PCR inhibitoriem augos.Tikmēr tas saglabā augstu amplifikācijas veiktspēju, kas ir piemērots DNS fragmentu amplifikācijai 5 kb robežās.Komplektā esošo unikālo līzes buferi A var izmantot svaigu vai saldētu augu audu lizēšanai.Tas ir viegli lietojams, un lizātu var izmantot kā veidni amplifikācijai bez attīrīšanas.Sistēma satur aizsargvielas, kas ļauj efektīvi pastiprināt neapstrādātus paraugus pēc atkārtotas sasaldēšanas un atkausēšanas.2 × Plant Direct Master Mix ir jāpievieno tikai primers un veidnes, lai veiktu amplifikācijas reakciju, tādējādi samazinot pipetes darbības un uzlabojot noteikšanas caurlaidību un rezultātu reproducējamību.
Sastāvdaļas
| Sastāvdaļas | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Plant Direct Master Mix | 1,25 ml | 4 × 1,25 ml |
| Augu tiešās līzes buferis A | 5 ml | 20 ml |
| Augu tiešās līzes buferis B* | 5 ml | 20 ml |
*Plant Direct Lysis Buffer B ir izvēles reaģents, ko izmanto, lai neitralizētu augu tiešās līzes buferi A, lai pagarinātu paraugu uzglabāšanas laiku.To var izmantot atbilstoši faktiskajai situācijai.
Uzglabāšanas apstākļi
2 × Stādiet Direct Master Mix, uzglabājiet -30 ~ -15 ℃ un izvairieties no atkārtotas sasaldēšanas un atkausēšanas;Augu tiešās līzes buferšķīdums, uzglabā -30 ~ -15 ℃ vai 2 ~ 8 ℃.
Eksperimenta process
Paraugu apstrāde–Augu Lapa
Tiešā metode:Ieteicams izmantot jaunas lapas.Izmantojiet caurumu ar fiksētu diametru 0,5–3 mm, lai iegūtu nelielu un viendabīgu paraugu, un pēc tam tieši pievienojiet paraugu PCR sistēmai (ieteicams 50 μl sistēma).Ņemiet vērā, ka paraugs atrodas PCR šķīdumā, nevis pret mēģenes sieniņu.Ja garu fragmentu un sarežģītu paraugu pastiprināšanai izmanto tiešo PCR, parauga ar mazāku diametru (0,5–1 mm) izmantošana var palīdzēt iegūt labākus rezultātus.
Slīpēšanas līzes metode:Ieteicams izmantot jaunas lapas.Paņemiet nelielu lapas gabalu (apmēram 1–3 mm diametrā), ievietojiet to 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab un sasmalciniet, cik vien iespējams (šo darbību var veikt, saspiežot lapu ar 100 μl pipetes galu lai sasmalcinātu paraugu) .Ja izmanto lielāku lapu audu daudzumu (nepārsniedz 7 mm), atšķaidīšanas buferšķīduma tilpumu palielina līdz 50 μl.Pēc lapu slīpēšanas šķīdumam vajadzētu parādīties zaļā krāsā.Pēc īsas centrifugēšanas pievienojiet 1 μl supernatanta PCR sistēmai kā reakcijas šablonu.
Termiskās līzes metode:Ieteicams izmantot jaunas lapas.Paņemiet nelielu lapas gabaliņu (apmēram 1–3 mm diametrā), ievietojiet to 20 μl augu tiešās līzes buferšķīdumā A un karsējiet 95°C 5–10 minūtes.Grūti lizējamām lapām līzes laiku var atbilstoši pagarināt (ne vairāk kā 20 min).Ja izmanto lielāku lapu audu daudzumu (nepārsniedz 7 mm), atšķaidīšanas buferšķīduma tilpumu palielina līdz 50 μl.Pēc karsēšanas īsi centrifugējiet un pievienojiet 1 μl supernatanta PCR sistēmai kā reakcijas šablonu.
Paraugu apstrāde-Augu sēklas
Slīpēšanas līzes metode:Izmantojiet skalpeli, lai sagrieztu sēklas ar 5 mm diametru, pievienojiet tās 100 μl augu tiešās līzes buferšķīduma A un sasmalciniet paraugu ar pipetes galu vai citiem instrumentiem.Īsi samaisiet un ļaujiet nostāvēties istabas temperatūrā 3-5 minūtes.Pārliecinieties, vai sēklu paraugs ir iegremdēts atšķaidīšanas buferšķīdumā.Pēc īsas centrifugēšanas pievienojiet 1 μl supernatanta PCR sistēmai kā reakcijas veidni.
Termiskās līzes metode:Izmantojiet skalpeli, lai sagrieztu sēklas ar 5 mm diametru, pievienojiet tās 100 μl augu tiešās līzes buferšķīduma A un karsējiet 95°C 5–10 minūtes.Līzes laiku var atbilstoši pagarināt lapām, kuras ir grūti lizējamas (ne vairāk kā 30 minūtes).Pēc karsēšanas īsi centrifugējiet un pievienojiet 1 μl supernatantu PCR sistēmai kā reakcijas šablonu.
a.Piemērota izmēra paraugu griešanai var izmantot arī šķēres vai citus instrumentus;ja perforators vai šķēres tiek izmantotas atkārtoti, pirms katras lietošanas tās jātīra ar 2% nātrija hipohlorīta šķīdumu, lai novērstu paraugu savstarpēju inficēšanos.
b.Pirms lietošanas pārliecinieties, vai Plant Direct Lysis Buffer ir pilnībā izkusis.Ja buferis ir viskozs vai tajā ir nogulsnes, pirms lietošanas to var karsēt līdz 37 ℃, lai tas pilnībā izkausētu.
c.Šablona tilpumu reakcijas sistēmā var atbilstoši pielāgot atbilstoši augu materiāla un pievienotā šķīdinātāja tilpuma atšķirībām.
Augu tiešās līzes buferis
Augu tiešās līzes buferis A, kas atrodas šajā produktā, ir stingri optimizēts, lai atbrīvotu lielāko daļu augu audu genomu, un ir piemērots neapstrādātu augu īslaicīgai uzglabāšanai 4 ℃ temperatūrā.Ja paraugs jāuzglabā ilgāku laiku (piem., 1 – 2 mēnešus), ieteicams supernatantu pārnest uz jaunu EP mēģeni un uzglabāt -20℃.Lai paraugus uzglabātu stabilāk, pārnestajam supernatantam pievienojiet vienādu tilpumu Plant Direct Lysis Buffer B, labi samaisiet un uzglabājiet -20 ℃.Stabilais uzglabāšanas laiks mainās atkarībā no augu paraugiem un stāvokļiem.
Reakcijas sistēma
| ddH2O | Līdz 20,0 µl | Līdz 50,0 µl |
| 2 × Plant Direct Master Mixa | 10,0 µl | 25,0 µ |
| Primer 1 (10 µM) | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Primer 2 (10 µM)b | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Augu lapu/neapstrādāta ekstrakta paraugs(Skatīt paraugu apstrāde) | 0,5 – 3 mm lapu disks/x µl | 0,5 – 3 mm lapu disks/x µl |
a.Tas satur Mg2+pie galīgās koncentrācijas 2 mM.
b.Katram gruntējumam ieteicams izmantot galīgo koncentrāciju 0,4 μM.Pārmērīga primeru izmantošana palielinās nespecifisku pastiprināšanos.
c.Izmantotā parauga daudzumu var pielāgot atbilstoši faktiskajai situācijai.Neapstrādāta lizētā parauga vienā reakcijā izmantoto daudzumu var regulēt no 2% līdz 20% no kopējā reakcijas tilpuma.Pārāk daudz paraugu izmantošana var izraisīt pastiprināšanas kļūmi.
Reakcijas programma
| Soļi | Temperatūra | Laiks |
| Sākotnējā denaturācija | 98℃ | 5 min |
| Denaturācija | 95℃ | 10 sek |
| Atkausēšana | 58 ~ 72 ℃ | 15 sek |
| Pagarinājums | 72℃ | 30 sek |
| Pēdējais pagarinājums | 72℃ | 5 min |
a.Sākotnējā denaturācija (98 ℃, 5 min) veicina augu audu līzi, atbrīvojot genoma DNS, ko var izmantot PCR amplifikācijai.Nesaīsiniet laiku un nesamaziniet temperatūru.
b.Ieteicams to iestatīt vienādu ar primera Tm vērtību vai par 2 ~ 4℃ augstāku par Tm vērtību.Šajā produktā izmantotā tiešās amplifikācijas DNS polimerāze atšķiras no parastās Taq DNS polimerāzes, un tai ir īpašas prasības reakcijas atkausēšanas temperatūrai ； Augstas atkausēšanas temperatūras izmantošana var efektīvi samazināt nespecifisko amplifikāciju un uzlabot amplifikācijas efektivitāti.Sarežģītām veidnēm efektīvu pastiprināšanu var panākt, pielāgojot atkausēšanas temperatūru un pagarinot pagarināšanas laiku.
c.Ja pastiprinājuma produkta garums ir ≤1 kb, pagarinājuma laiks ir iestatīts uz 30 sek/kb;ja pastiprinājuma produkta garums ir >1 kb, pagarinājuma laiks ir iestatīts uz 60 sek/kb.
d.Sarežģītiem paraugiem vai paraugiem ar zemu pastiprināšanas iznākumu ciklu skaitu var atbilstoši palielināt līdz 40–50 cikliem.
Lietojumprogrammas
Tas ir piemērots tiešai augu audu pastiprināšanai un augu paraugu augstas caurlaidības skrīningam, kas nesatur polisaharīdus un polifenolus.
Piezīmes
Izmantošanai tikai pētniecībā.Nav paredzēts lietošanai diagnostikas procedūrās.
1. Neapstrādātai augu amplifikācijai vai tiešai amplifikācijai pirms eksperimenta uzsākšanas ieteicams izmantot attīrītu genoma DNS kā pozitīvu kontroli, lai pārliecinātos, ka sistēma, primeri un darbības ir pareizas.
2. Šajā komplektā izmantotajai tiešās amplifikācijas DNS polimerāzei ir spēcīga korektūras darbība.Ja nepieciešams veikt TA klonēšanu, pirms adenīna pievienošanas ieteicams attīrīt DNS.
3. Primer Design Guidelines:
a.Ieteicams, lai pēdējā bāze gruntskrāsas 3′ galā būtu G vai C.
b.Jāizvairās no secīgām neatbilstībām pēdējās 8 bāzēs gruntskrāsas 3′ galā.c.Izvairieties no matadatu struktūrām gruntskrāsas 3′ galā.
d.Forward primer un reverse primer Tm vērtības atšķirībām nevajadzētu pārsniegt 1 ℃, un Tm vērtībai jābūt noregulētai uz 60 ~ 72 ℃ (Tm vērtības aprēķināšanai ieteicams lietot Primer Premier 5).
e.Aprēķinot primera Tm vērtību, nevajadzētu iekļaut papildu papildu primer secības, kas nav saskaņotas ar veidni.
f.Ieteicams, lai gruntējuma GC saturs būtu 40% -60%.
g.Kopējam A, G, C un T sadalījumam gruntskrāsā jābūt pēc iespējas vienmērīgākam.Neizmantojiet reģionus ar augstu GC vai AT saturu.
h.Izvairieties no komplementāru 5 vai vairāk bāzu sekvenču klātbūtnes praimerī vai starp diviem primeriem un izvairieties no 3 vai vairāk bāzu komplementāru sekvenču klātbūtnes divu praimeru 3′ galā.
i.Izmantojiet funkciju NCBI BLAST, lai pārbaudītu primera specifiku, lai novērstu nespecifisku pastiprināšanos.
