2 × Sensi Direct premikss-UNG (zonde qPCR)
Kaķa Nr.: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) ir paredzēts, lai veiktu PCR tieši no paraugiem bez DNS ekstrakcijas vai parauga sagatavošanas.Šis reaģents sastāv no karstās palaišanas DNS polimerāzes, uracila DNS glikozilāzes (UNG), RNāzes inhibitora, MgCl2, dNTP (ar dUTP, nevis dTTP) un stabilizatorus kvantitatīvai PCR (qPCR).Šis reaģents nodrošina augstu inhibitoru toleranci, un tādējādi to var tieši izmantot tādu paraugu noteikšanai kā rīkles uztriepes, siekalas, antikoagulētas asinis, plazma un serums bez DNS ekstrakcijas.Reaģents izmanto patentētu buferi qPCR ar jauktiem anti-inhibējošās DNS polimerāzes un UNG enzīmu enzīmiem.Tāpēc tas var iegūt labu mērķa gēnu amplifikāciju paraugos, kas satur inhibitorus, un kavē viltus pozitīvu amplifikāciju, ko izraisa PCR atlikušais un aerosola piesārņojums.Šis reaģents ir savietojams ar lielāko daļu fluorescējošu kvantitatīvo PCR instrumentu, piemēram, Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche un tā tālāk.
Sastāvdaļas
1. 50 × SensiDirect enzīmu/UNG maisījums
2. 2 × SensiDirect premiksa buferis (dUTP)
Uzglabāšanas apstākļi
Visas sastāvdaļas jāuzglabā -20 ℃ temperatūrā ilgstošai uzglabāšanai un 4 ℃ temperatūrā līdz 3 mēnešiem.Lūdzu, rūpīgi samaisiet pēc atkausēšanas un centrifugējiet pirms lietošanas.Izvairieties no biežas sasaldēšanas-atkausēšanas.
Riteņbraukšanas protokols
| Solis | Temperatūra | Laiks | Cikls |
| Gremošana | 50℃ | 2 min | 1 |
| Polimerāzes aktivizēšana | 95℃ | 1-5 min | 1 |
| Denaturācija | 95℃ | 10-20s | 40-50 |
| Atkausēšana/pagarināšana | 56-64℃ | 20-60 |
Pipetēšanas instrukcijas
| Reaģents | Apjoms uz reakcija | Tilpums uz vienu reakciju | Galīgā koncentrācija |
| 2 × SensiDirect premiksa buferis (dUTP) | 12,5 µL | 25 µL | 1× |
| 50 × SensiDirect enzīmu/UNG maisījums | 0,5 µL | 1µL | 1× |
| 25 × Primer-Probe Mix1, 2 | 1µL | 2µL | 1× |
| Paraugs3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Kopējais apjoms | 25 μL | 50 μL | - |
1. Primer galīgā koncentrācija parasti ir 0,2 μM.Lai iegūtu labākus rezultātus, grunts koncentrāciju var optimizēt diapazonā no 0,2 līdz 1 μM.
2. Parasti zondes koncentrāciju var optimizēt diapazonā no 0,1 līdz 0,3 μM.Zondes optimālā koncentrācija ir saistīta ar reālā laika PCR pastiprināšanas instrumentu, zondes veidu un fluorescējošās marķējuma vielas veidu.Lūdzu, skatiet instrumenta rokasgrāmatu vai katras fluorescējošās zondes īpašās prasības.
3. Dažādu veidu paraugi satur dažāda veida un satura inhibitoru un mērķa gēna kopiju skaitu.Parauga tilpums jāņem vērā pēc faktiskā stāvokļa.Ja nepieciešams, paraugu atšķaida, pievienojot ūdeni bez nukleāzes vai TE buferšķīdumu.
4. Ieteicamais dažādu paraugu apjoms:
| Paraugs | Apjoms vienam 50 μL reakcija | Maksimums attiecība |
| Antikoagulētas pilnas asinis | 2,5 μL | 5% |
| Plazma | 15 μL | 30% |
| Serums | 10 μL | 20% |
| Kakla uztriepe | 10 μL | 20% |
| Siekalas | 10 μL | 20% |
Kvalitātes kontrole
1. Funkciju noteikšana: qPCR jutīgums, specifiskums un atkārtojamība.
2. Nav eksogēnas nukleāzes aktivitātes: nav eksogēnas endonukleāzes un eksonukleāzes piesārņojuma.
Produkta piezīmes
1. Šis produkts izmanto jauna veida karstās palaišanas DNS polimerāzi, kuru var aktivizēt 1-5 minūšu laikā. Tā kā tā reakcijas buferis ir optimizēts, tas ir vairāk piemērots dubultai vai daudzkārtējai fluorescences kvantitatīvai PCR, izmantojot zondes metodi.
2. Ja PCR pastiprinājuma Rn vērtība ir pārāk zema vai amplifikācija ir acīmredzami kavēta, parauga daudzuma samazināšana, reakcijas tilpuma palielināšana vai iepriekšēja parauga atšķaidīšana var uzlabot rezultātus.
3. Asins, siekalu, urīna, rīkles uztriepes utt. savākšanai jāatbilst klīnisko kritēriju prasībām, un svaigu paraugu var izmantot, lai novērstu nukleīnskābju noārdīšanos.
4. Tā kā dažādiem amplikoniem ir atšķirīga izmantošanas efektivitāte no dUTP un jutība pret UNG, reaģenti ir jāoptimizē, ja, izmantojot UNG sistēmu, noteikšanas jutība samazinās.Ja nepieciešams, lūdzu, sazinieties ar mums, lai saņemtu tehnisko atbalstu.
5. Lai izvairītos no pārnēsāto PCR produktu amplifikācijas starp vienpakāpes reakcijām, amplifikācijai ir nepieciešama īpaša eksperimentālā zona un pipete.Darbojieties ar cimdiem un bieži mainiet, un pēc PCR pastiprināšanas neatveriet reakcijas cauruli.
