5 × Neoscript Fast RT-qPCR Premiks plus-UNG
Kaķa Nr.: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) ir ļoti stabils vienas mēģenes zondes maisījums, kas piemērots vienpakāpes reversajai transkripcijai un kvantitatīvai PCR (qRT-PCR).Tas atbalsta gruntskrāsu un zondu iepriekšēju sajaukšanu un saglabā stabilitāti pēc ilgstošas uzglabāšanas zemā temperatūrā.Pārbaudāmo paraugu var pievienot tieši lietošanas laikā, bez papildu caurules atvēršanas/pipetēšanas.Šis produkts nodrošina sastāvdaļas, piemēram, karstās palaišanas DNS polimerāzi, M-MLV, karstumlabilā uracila DNS glikozilāzi (TS-UNG), RNāzes inhibitoru, MgCl2, dNTP (ar dUTP, nevis dTTP) un stabilizatorus.Ar ģenētiski modificēto ātrās amplifikācijas reverso transkriptāzi un DNS polimerāzi PCR amplifikāciju iespējams pabeigt 20-40 minūšu laikā.Šis reaģents izmanto īpašu buferi qPCR ar jauktiem anti-inhibējošā amplifikācijas enzīma un UNG enzīma enzīmiem.Tāpēc tas var iegūt labu mērķa gēnu amplifikāciju un novērst viltus amplifikāciju, ko izraisa PCR atlikuma un aerosola piesārņojums.Šis reaģents ir savietojams ar lielāko daļu fluorescences kvantitatīvo PCR instrumentu no tādiem ražotājiem kā Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad un Roche.
Komponents
1.25 × Neoscript Fast RTase/UNG mix
2.5 × Neoscript Fast RT premiksa buferis (dUTP)
Uzglabāšanas apstākļi
Visas sastāvdaļas jāuzglabā -20 ℃ temperatūrā ilgstošai uzglabāšanai un 4 ℃ temperatūrā līdz 3 mēnešiem.Lūdzu, rūpīgi samaisiet pēc atkausēšanas un centrifugējiet pirms lietošanas.Izvairieties no biežas sasaldēšanas-atkausēšanas.
qRT-PCR reakcijas sistēmas sagatavošana
| Sastāvdaļas | 25μLSistēma | 50μLSistēma | Galīgā koncentrācija |
| 5 × Neoscript Fast RT premiksa buferis (dUTP) | 5μL | 10 μL | 1× |
| 25 × Neoscript Fast RTase/UNG mix | 1 μL | 2μL | 1× |
| 25 × Primer-Probe Mixa | 1 μL | 2μL | 1× |
| Veidnes RNSb | – | – | – |
| ddH2O | Līdz 25 μL | Līdz 50 μL | – |
1) a.Gruntējuma galīgā koncentrācija parasti ir 0,2 μM.Lai iegūtu labākus rezultātus, grunts koncentrāciju var optimizēt diapazonā no 0,2 līdz 1 μM.Parasti zondes koncentrāciju var optimizēt diapazonā no 0,1 līdz 0,3 μM.
2) b. Lietojot ātro PCR procedūru, palielinot praimeru un zondu koncentrāciju, var iegūt labākus amplifikācijas rezultātus, un to attiecība ir attiecīgi jāoptimizē.
3) Dažādu veidu paraugi satur dažāda veida un satura inhibitoru un mērķa gēna kopiju skaitu.Parauga tilpums jāņem vērā pēc faktiskā stāvokļa.Ja nepieciešams, paraugu atšķaida ar nukleāzi nesaturošu ūdeni vai TE buferšķīdumu.
Reakcija Cnosacījumi
| Regulāra PCR procedūra | Ātra PCR procedūra | ||||||
| Procedūra | Temp. | Laiks | Cikls | Procedūra | Temp. | Laiks | Cikls |
| Reversā transkripcija | 50℃ | 10-20 minūtes | 1 | Reversā transkripcija | 50℃ | 5 min | 1 |
| Polimerāze Aktivizēšana | 95℃ | 1-5 minūtes | 1 | Polimerāze Aktivizēšana | 95℃ | 30. gadi | 1 |
| Denaturācija | 95℃ | 10-20s | 40-50 | Denaturācija | 95℃ | 1-3s | 40-50 |
| Atkausēšana un Pagarinājums | 56-64℃ | 20-60 | Atkausēšana un Pagarinājums | 56-64℃ | 3-20s | ||
Kvalitātes kontrole
1.Funkciju noteikšana: qPCR jutība, specifiskums un atkārtojamība.
2.Nav eksogēnas nukleāzes aktivitātes: nav eksogēnas endonukleāzes un eksonukleāzes piesārņojuma.
Piezīmes
1.Ātrās DNS polimerāzes amplifikācijas ātrums nav mazāks par 1kb/10s.Dažādiem PCR instrumentiem ir dažādi sildīšanas un dzesēšanas ātrumi, temperatūras kontroles režīmi un siltumvadītspēja, tāpēc ir svarīgi optimizēt jūsu primer/zondes koncentrāciju un darbības metodi kopā ar jūsu īpašo ātrās PCR instrumentu.
2.Šim produktam ir plaša pielietojamība, un tas ir piemērots augstas jutības molekulārajai diagnostikai.Trīspakāpju PCR metode ir ieteicama primeriem ar zemu atkausēšanas temperatūru vai garu fragmentu pastiprināšanai virs 200 bp.
3.Tā kā dažādiem amplikoniem ir atšķirīga dUTP izmantošanas efektivitāte un atšķirīga jutība pret UNG, reaģenti ir jāoptimizē, ja, izmantojot UNG sistēmu, noteikšanas jutība samazinās.Ja nepieciešams, lūdzu, sazinieties ar mums, lai saņemtu tehnisko atbalstu.
4.Lai izvairītos no pārnēsāto PCR produktu amplifikācijas, pastiprināšanai ir nepieciešama īpaša eksperimentālā zona un pipete.Darbojieties ar cimdiem un bieži mainiet, un pēc pastiprināšanas neatveriet PCR cauruli.
