Proteināze K mNGS (šķidrums)
Proteināze K ir stabila serīna proteāze ar plašu substrāta specifiku.Tas noārda daudzus proteīnus sākotnējā stāvoklī pat mazgāšanas līdzekļu klātbūtnē.Pierādījumi no kristāla un molekulārās struktūras pētījumiem liecina, ka enzīms pieder subtilizīnu saimei ar aktīvās vietas katalītisko triādi (Asp39-Viņa69-Ser224).Dominējošā šķelšanās vieta ir peptīdu saite, kas atrodas blakus alifātisko un aromātisko aminoskābju karboksilgrupai ar bloķētām alfa aminogrupām.To parasti izmanto tās plašās specifikas dēļ.Šī proteināze K ir īpaši izstrādāta mNGS.Salīdzinot ar citu proteināzi K, tajā ir vēl mazāks nukleīnskābju piesārņojums ar tādu pašu enzīmu veiktspēju, kas varētu labāk nodrošināt pakārtoto mNGS lietošanu.
Uzglabāšanas apstākļi
2-8℃ 2 gadus
Specifikācija
| Izskats | Bezkrāsains līdz gaiši brūns šķidrums |
| Aktivitāte | ≥800 V/ml |
| Olbaltumvielu koncentrācija | ≥20 mg/ml |
| Nikase | Neviens nav konstatēts |
| DNSāze | Neviens nav konstatēts |
| RNāze | Neviens nav konstatēts |
Īpašības
| EK numurs | 3.4.21.64(Rekombinants no Tritirachium albuma) |
| Izoelektriskais punkts | 7.81 |
| Optimālais pH | 7.0- 12.0 1. att |
| Optimāla temperatūra | 65 ℃ 2. att |
| pH stabilitāte | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 h) 3. att. |
| Termiskā stabilitāte | Zem 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) 4. att |
| Uzglabāšanas stabilitāte | Vairāk nekā 90% aktivitātes 12 mēnešus 25 ℃ temperatūrā |
| Aktivatori | SDS, urīnviela |
| Inhibitori | diizopropilfluorfosfāts;fenilmetilsulfonilfluorīds |
Lietojumprogrammas
1. Ģenētiskās diagnostikas komplekts
2. RNS un DNS ekstrakcijas komplekti
3. Neolbaltumvielu komponentu ekstrakcija no audiem, olbaltumvielu piemaisījumu, piemēram, DNS, degradācijavakcīnas un heparīna sagatavošana
4. Hromosomu DNS sagatavošana ar impulsa elektroforēzi
5. Western blot
6. Enzīmu glikozilētā albumīna reaģentu in vitro diagnostika
Piesardzības pasākumi
Lietojot vai sverot, valkājiet aizsargcimdus un aizsargbrilles, un pēc lietošanas uzglabājiet labu ventilāciju.Šis produkts var izraisīt ādas alerģisku reakciju un nopietnu acu kairinājumu.Ja ieelpots, tas var izraisīt alerģiju vai astmas simptomus vai aizdusu.Var izraisīt elpceļu kairinājumu.
Vienības definīcija
Viena vienība (U) tiek definēta kā fermenta daudzums, kas nepieciešams kazeīna hidrolizēšanai, lai iegūtu 1 μmoltirozīna minūtē šādos apstākļos.
Reaģentu sagatavošana
Reaģents I: 1 g piena kazeīna tika izšķīdināts 50 ml 0,1 M nātrija fosfāta šķīduma (pH 8,0), inkubēts 65-70 ℃ ūdenī 15 minūtes, maisīts un izšķīdināts, atdzesēts ar ūdeni, noregulēts ar nātrija hidroksīdu līdz pH 8,0 un fiksēts tilpums. 100 ml.
Reaģents II: 0,1 M trihloretiķskābe, 0,2 M nātrija acetāts, 0,3 M etiķskābe.
Reaģents III: 0,4 M Na2CO3risinājums.
Reaģents IV: Fortu reaģents, kas 5 reizes atšķaidīts ar tīru ūdeni.
Reaģents V: Enzīmu šķīdinātājs: 0,1 M nātrija fosfāta šķīdums (pH 8,0).
Reaģents VI: tirozīna šķīdums: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tirozīns, izšķīdināts ar 0,2M HCl.
Procedūra
1. 0,5 ml reaģenta I iepriekš uzsilda līdz 37 ℃, pievieno 0,5 ml enzīma šķīduma, labi samaisa un inkubē37℃ 10 minūtes.
2. Pievienojiet 1 ml reaģenta II, lai apturētu reakciju, labi samaisiet un turpiniet inkubēt 30 minūtes.
3. Centrifugējiet reakcijas šķīdumu.
4. Paņemiet 0,5 ml supernatanta, pievienojiet 2,5 ml reaģenta III, 0,5 ml reaģenta IV, labi samaisiet un inkubējiet 37 ℃.uz 30 min.
5. OD660tika noteikts kā OD1;tukšā kontroles grupa: 0,5 ml reaģenta V izmanto, lai aizstātu fermenturisinājums OD noteikšanai660kā OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. L-tirozīna standarta līkne: 0,5 ml dažādas koncentrācijas L-tirozīna šķīduma, 2,5 ml reaģenta III, 0,5 ml reaģenta IV 5 ml centrifūgas mēģenē, inkubēt 37 ℃ 30 minūtes, noteikt OD660dažādām L-tirozīna koncentrācijām, iegūst standarta līkni Y=kX+b, kur Y ir L-tirozīna koncentrācija, X ir OD600.
Aprēķins
2: kopējais reakcijas šķīduma tilpums (ml)
0,5: fermenta šķīduma tilpums (ml)
0,5: hromogēnajā noteikšanā izmantotais reakcijas šķidruma tilpums (ml)
10: reakcijas laiks (min)
Df: Atšķaidīšanas daudzkārtējs
C: Enzīmu koncentrācija (mg/ml)
Atsauces
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.Commun.(1971);44:513.
3. Hilzs, H.un citi.,Eiro.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambruks Džet al., Molekulārā klonēšana: laboratorijas rokasgrāmata, 2. izdevums, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Skaitļi
att.1 Optimāls pH
100mM buferšķīdums:pH6,0-8,0, Na-fosfāts;pH 8,0-9,0, Tris-HCl;pH 9,0-12,5, Glicīns-NaOH. Fermentu koncentrācija: 1mg/mL
2. att. Optimālā temperatūra
Reakcija 20 mM K-fosfāta buferšķīdumā pH 8,0.Fermentu koncentrācija: 1 mg/mL
3. att. pH Stabilitāte
25 ℃, 16 h-apstrāde ar 50 mM buferšķīdumu: pH 4,5-5,5, Acetāts;pH 6,0-8,0, Na-fosfāts;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, Glicīns-NaOH.Fermentu koncentrācija: 1 mg/mL
4. att. Termiskā stabilitāte
30 min. apstrāde ar 50 mM Tris-HCl buferšķīdumu, pH 8,0.Fermentu koncentrācija: 1 mg/mL
5. att. Uzglabāšana stability at 25℃
