Proteināze K NGS (pulveris)
Kaķa Nr.: HC4507A
NGS proteāze K ir stabila serīna proteāze ar augstu enzīmu aktivitāti un plašu substrāta specifiskumu. Enzīms galvenokārt sadala estera saites un peptīdu saites, kas atrodas blakus hidrofobo aminoskābju, sēru saturošu aminoskābju un aromātisko aminoskābju C-galam.Tātad to bieži izmanto, lai olbaltumvielas sadalītu īsos peptīdos.NGS proteāze K ir tipiska serīna proteāze ar Asp39-Viņa69-Ser224katalītiskā triāde, kas ir raksturīga tikai serīna proteāzēm, un katalītisko centru ieskauj pavilcējs Ca2+saistīšanās vietas stabilizēšanai, saglabājot augstu enzīmu aktivitāti plašākā apstākļu diapazonā.
Specifikācija
| Izskats | Balts vai gandrīz balts amorfs pulveris, liofilizēts |
| Konkrēta darbība | ≥40 V/mg cietas vielas |
| DNSāze | Neviens nav konstatēts |
| RNāze | Neviens nav konstatēts |
| Bioslodze | ≤50 KVV/g cietas vielas |
| Nukleīnskābes atlikums | <5pg/mg cietas vielas |
Īpašības
| Avots | Tritirahija albums |
| EK numurs | 3.4.21.64(Rekombinants no Tritirachium albuma) |
| Molekulārais svars | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Izoelektriskais punkts | 7.81 1. att |
| Optimālais pH | 7,0-12,0 (Visi veic augstu aktivitāti) 2. att |
| Optimāla temperatūra | 65℃ 3. att |
| pH Stabilitāte | pH 4,5-12,5 (25℃,16h) 4.att |
| Termiskā stabilitāte | Zem 50℃ (pH 8,0, 30 min) 5. att |
| Uzglabāšanas stabilitāte | Uzglabāts 25 ℃ 12 mēnešus 6. att |
| Aktivatori | SDS, urīnviela |
| Inhibitori | diizopropilfluorfosfāts;benzilsulfonilfluorīds |
Uzglabāšanas apstākļi
Glabājiet liofilizēto pulveri -25 ~ -15 ℃ temperatūrā ilgu laiku prom no gaismas;Pēc izšķīdināšanas sadaliet alikvotu atbilstošā tilpumā īslaicīgai uzglabāšanai 2–8 ℃ temperatūrā prom no gaismas vai ilgstošai uzglabāšanai -25–15 ℃ prom no gaismas.
Piesardzības pasākumi
Lietojot vai sverot, valkājiet aizsargcimdus un aizsargbrilles, un pēc lietošanas uzglabājiet labu ventilāciju.Šis produkts var izraisīt ādas alerģisku reakciju un nopietnu acu kairinājumu.Ja ieelpots, tas var izraisīt alerģiju vai astmas simptomus vai aizdusu.Var izraisīt elpceļu kairinājumu.
Vienības definīcija
Viena NGS proteāzes K vienība ir definēta kā fermenta daudzums, kas nepieciešams, lai standarta noteikšanas apstākļos hidrolizētu kazeīnu par 1 μmol L-tirozīna.
Reaģentu sagatavošana
| Reaģents | Ražotājs | Katalogs |
| Kazeīns tehniskaisno liellopu piena | Sigma Oldriha | C7078 |
| NaOH | Sinopharm ķīmiskā vielaReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4· 2H2O | Sinopharm ķīmiskā vielaReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm ķīmiskā vielaReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Trihloretiķskābe | Sinopharm ķīmiskā vielaReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Nātrija acetāts | Sinopharm ķīmiskā vielaReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Etiķskābe | Sinopharm ķīmiskā vielaReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm ķīmiskā vielaReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Nātrija karbonāts | Sinopharm ķīmiskā vielaReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Folīns-fenols | Sangon Biotech (Šanhaja)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-tirozīns | Sigma | 93829 |
Reaģents I:
Substrāts: 1% kazeīns no liellopu piena šķīduma: izšķīdiniet 1 g liellopu piena kazeīna 50 ml 0,1 M nātrija fosfāta šķīduma, pH 8,0, karsējiet ūdens vannā 65-70 °C 15 minūtes, samaisiet un izšķīdiniet, atdzesējiet ar ūdeni, regulējot nātrija hidroksīdu līdz pH 8,0 un atšķaida līdz 100 ml.
Reaģents II:
TCA šķīdums: 0,1 M trihloretiķskābe, 0,2 M nātrija acetāts un 0,3 M etiķskābe (secīgi nosveriet 1,64 g trihloretiķskābes + 1,64 g nātrija acetāta + 1,724 ml etiķskābes, pievienojiet 50 ml dejonizēta ūdens, atšķaidiet ar 4,0 HCl līdz 3. 100 ml).
Reaģents III:
0,4 m nātrija karbonāta šķīdums (nosveriet 4,24 g bezūdens nātrija karbonāta un izšķīdiniet 100 ml ūdens)
Reaģents IV:
Folīna fenola reaģents: atšķaida 5 reizes ar dejonizētu ūdeni.
Reaģents V:
Enzīmu šķīdinātājs: 0,1 M nātrija fosfāta šķīdums, pH 8,0.
Reaģents VI:
L-tirozīna standartšķīdums: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-tirozīns, kas izšķīdināts ar 0,2 M HCl.
Procedūra
1. Ieslēdziet UV-Vis spektrofotometru un izvēlieties fotometrisko mērījumu.
2. Iestatiet viļņa garumu 660 nm.
3. Ieslēdziet ūdens vannu, iestatiet temperatūru uz 37℃, nodrošiniet nemainīgu temperatūru 3-5 minūtes.
4. Uzsildiet 0,5 ml substrāta 2 ml centrifūgas mēģenē 37 ℃ ūdens vannā 10 minūtes.
5. Ekstrahējiet 0,5 ml atšķaidīta enzīma šķīduma iepriekš uzkarsētā centrifūgas mēģenē 10 minūtes.Iestatīt fermentu šķīdinātāju kā tukšo grupu.
6. Tūlīt pēc reakcijas pievienojiet 1,0 ml TCA reaģenta.Labi samaisa un inkubē ūdens vannā 30 minūtes.
7. Centrifugējiet reakcijas šķīdumu.
8. Pievienojiet tālāk norādītās sastāvdaļas norādītajā secībā.
| Reaģents | Skaļums |
| Supernatants | 0,5 ml |
| 0,4M nātrija karbonāts | 2,5 ml |
| Folīna fenola reaģents | 0,5 ml |
9. Pirms inkubācijas ūdens vannā 37℃ 30 minūtes labi samaisiet.
10. OD660tika noteikts kā OD1;tukšā parauga kontroles grupa: fermentu šķīdinātāju izmanto, lai aizstātu enzīma šķīdumu, lai noteiktu OD660kā OD2, ΔOD=OD1-OD2.
11. L-tirozīna standarta līkne: 0,5 ml dažādas koncentrācijas L-tirozīna šķīduma, 2,5 ml 0,4 M nātrija karbonāta, 0,5 ml folīna fenola reaģenta 5 ml centrifūgas mēģenē, inkubēt 37 ℃ 30 minūtes, noteikt OD660dažādām L-tirozīna koncentrācijām, iegūst standarta līkni Y=kX+b, kur Y ir L-tirozīna koncentrācija, X ir OD600.
Aprēķins
2: kopējais reakcijas šķīduma tilpums (ml)
0,5: fermenta šķīduma tilpums (ml)
0,5: hromogēnajā noteikšanā izmantotais reakcijas šķidruma tilpums (ml)
10: reakcijas laiks (min)
Df: Atšķaidīšanas daudzkārtējs
C: Enzīmu koncentrācija (mg/ml)
Skaitļi
1. att. DNS atlikums
| Paraugs | Ave C4 | Nukleīnskābe Atgūšana (pg/mg) | Atgūšana (%) | Kopējais nukleīns Skābe ( pg/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| RNS nesaturošs H2O | Nenoteikts | — | — | — |
2. att. Optimālais pH
3. att. Optimālā temperatūra
4. att. pH stabilitāte
5. att. Termiskā stabilitāte
6. att. Uzglabāšanas stabilitāte pie 25 ℃
