EndoFree Plasmid Maxi komplekts
Šis komplekts ir piemērots ekstrakcijai no 150–300 ml baktēriju šķīduma, kas kultivēts pa nakti, izmantojot uzlabotu SDS-sārmainās līzes metodi baktēriju lizēšanai.Neapstrādāts ekstrakts ir selektīvi apvienots ar unikālu Endotoxin Scavenger un atdalīts ar centrifugēšanu, lai noņemtu endotoksīnus.Pēc tam silikagela membrāna selektīvi saistās ar plazmīdas DNS šķīdumā augsta sāls un zema pH apstākļos.Tam seko mazgāšanas buferšķīduma pievienošana, lai noņemtu piemaisījumus un citus baktēriju komponentus.Visbeidzot, tīras plazmīdas DNS eluēšanai no silīcija matricas membrānas izmanto eluēšanas buferšķīdumu ar zemu sāls saturu un augstu pH līmeni.Silikagēla membrānā tiek izmantota īpaša adsorbcijas membrāna, un adsorbcijas daudzuma atšķirība starp kolonnu un kolonnu ir ļoti maza, un atkārtojamība ir laba.Fenols, hloroforms un citi toksiski reaģenti nav nepieciešami, kā arī etanola izgulsnēšanas soļi.Šo komplektu var izmantot, lai ātri ekstrahētu 0,2–1,5 mg tīras augstas kopijas plazmīdas DNS ar ekstrakcijas ātrumu 80–90%.Komplektā tiek izmantota unikāla procesa formula, kas noņem endotoksīnu, endotoksīna saturs ir ārkārtīgi zems un šūnu transfekcijas efekts ir lielisks.Ekstrahēto plazmīdu var tieši izmantot fermentu šķelšanā, PCR, in vitro transkripcijā, transformācijā, sekvencēšanā un citos molekulārās bioloģijas eksperimentos.
Uzglabāšanas apstākļi
RNaseA jāuzglabā temperatūrā -30 ~ -15 ℃ un jātransportē ≤ 0 ℃.
Endotoxin Scavenger var uzglabāt 2 ~ 8 ℃ temperatūrā vienu mēnesi, uzglabāt -30 ~ -15 ℃ ilgstošai uzglabāšanaiun transportēts ≤0 ℃ temperatūrā.
Pārējās sastāvdaļas jāuzglabā istabas temperatūrā (15 ~ 25 ℃) un jātransportē istabas temperatūrā.
Sastāvdaļas
| Sastāvdaļas | 10RXNS |
| RNāze A | 750 μl |
| Buferis P1 | 75 ml |
| Buferis P2 | 75 ml |
| Buferis P4 | 75 ml |
| Endotoksīnu iznīcinātājs | 25 ml |
| Buferis PW | 2 × 22 ml |
| TB buferis | 20 ml |
| FastPure DNA Maxi kolonnas (katra 50 ml savākšanas mēģenē) | 10 |
| Savākšanas caurule bez endotoksīniem | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, izmanto RNS noņemšanai.
Buferis P1:baktēriju suspensijas buferšķīdums, pirms pirmās lietošanas pievienojiet RNaseA buferšķīdumam P1.
Buferis P2:baktēriju līzes buferšķīdums (satur SDS/NaOH).
Buferis P4:neitralizējošais buferis.
Endotoksīnu iznīcinātājs:efektīvi izvada endotoksīnu no neapstrādāta plazmīda ekstrakta.
Buferis PW:mazgāšanas buferšķīdumā, pirms pirmās lietošanas pievienojiet noteikto etanola daudzumu.
TB buferis:eluācijas buferis.
FastPure DNA Maxi kolonnas:plazmīdu DNS adsorbcijas kolonnas.
Savākšanas tūbiņas 50 ml:filtrātu savākšanas caurules.
Savākšanas caurule bez endotoksīniem:plazmīdu DNS savākšanas caurules.
Sagatavotie materiāli
Absolūtais etanols, izopropanols, 50 ml centrifūgas mēģenes ar apaļu dibenu un 50 ml bez endotoksīniemcentrifūgas caurules.
Lietojumprogrammas
Šis produkts ir piemērots liela mēroga plazmīdu ekstrakcijai no 150 - 300 ml baktēriju šķīdumakultivēts pa nakti.
Eksperimenta process
1. Ņem 150 – 200 ml (ne vairāk kā 300 ml) baktēriju šķīduma, kas kultivēts nakti, un centrifugē pieapmēram 11 000 apgr./min (12 000 × g) 1–2 minūtes.Izmetiet supernatantu un savāciet baktērijas.
Δ Savācot vairāk nekā 50 ml baktēriju šķīduma, baktērijas var savākt, pievienojot baktēriju šķīdumu, centrifugējot, izmetot supernatantu un veicot citas darbības tajā pašā 50 ml mēģenē.
vairākas reizes.
2. Pievienojiet centrifūgai 7,5 ml buferšķīduma P1 (lūdzu, pārbaudiet, vai RNaseA ir pievienots buferšķīdumam P1).mēģenē, kurā ir baktērijas, un rūpīgi samaisiet ar virpuļošanu vai pipeti.
Δ Pilnīga baktēriju resuspensija šajā posmā ir ļoti svarīga, lai iegūtu ražu, un pēc atkārtotas suspensijas nedrīkst būt baktēriju kopas.Ja ir baktēriju gabali, kas nav rūpīgi sajaukti, tas ietekmēs līzi, kā rezultātā samazināsies raža un tīrība.Ja baktēriju šķīduma OD600 ir 0,65, tad, ekstrahējot no 150 ml baktēriju šķīduma, ieteicams izmantot 7,5 ml buferšķīduma P1;ja OD600 ir 0,75, jāizmanto 8 ml buferšķīduma P1 un attiecīgi jāmaina buferšķīduma P2 un P4 tilpumi.Ja baktēriju šķīduma tilpumu palielina līdz 200 ml, ieteicamsproporcionāli jāpalielina buferu P1, P2 un P4 tilpums.
3. Pievienojiet 7,5 ml buferšķīduma P2 baktēriju suspensijai no 2. darbības un viegli samaisiet uz augšu un uz leju 6–8reizes un inkubēt istabas temperatūrā 4 – 5 minūtes.
Δ Uzmanīgi apgrieziet, lai rūpīgi samaisītu.Vorteksēšana izraisīs genoma DNS fragmentāciju, kā rezultātā ekstrahētajā plazmīdā izveidosies genoma DNS fragmenti.Šajā laikā šķīdums kļūst viskozs un caurspīdīgs, parādot, ka baktērijas ir pilnībā lizētas.Lai izvairītos no plazmīdu iznīcināšanas, ilgums nedrīkst pārsniegt 5 minūtes.Ja šķīdums nav dzidrs, var rasties pārāk daudz baktērijunepilnīga līze, tāpēc baktēriju daudzums ir atbilstoši jāsamazina.
4. Pievienojiet 7,5 ml buferšķīduma P4 baktēriju suspensijai no 3. darbības un nekavējoties viegli apgrieziet to 6–8 reizes, lai ļautu šķīdumam pilnībā neitralizēt buferšķīdumu P2.Šajā laikā vajadzētu parādīties baltām flokulējošām nogulsnēm.Centrifugējiet ar ātrumu vairāk nekā aptuveni 11 000 apgr./min (12 000 × g) 10–15 minūtes, uzmanīgi ar pipeti ievietojiet supernatantu jaunā 50 ml apaļa dibena centrifūgas mēģenē (pašsagatavota) un izvairieties noaspirējiet peldošās baltas nogulsnes.
Δ Pievienojiet buferšķīdumu P4 un nekavējoties apgrieziet, lai labi samaisītu.Atstājiet mēģeni nostāvēties, līdz baltās nogulsnes vienmērīgi sadalās pa visu šķīdumu, lai novērstu vietējo nokrišņu veidošanos, kas varētu ietekmēt neitralizāciju.Ja pirms centrifugēšanas nav viendabīgu baltu flokulantu nogulsnes un pēc centrifugēšanas supernatants nav dzidrs, mēģeni varcentrifugē vēl 5 minūtes.
5. Pievienojiet 0,1 reizi lielāku tilpumu (10% no supernatanta tilpuma, apmēram 2,2 ml) Endotoxin Scavenger supernatantam no 4. darbības un apgrieziet, lai sajauktu.Ievietojiet šķīdumu ledus vannā vai ievietojiet sasmalcinātā ledū (vai ledusskapja saldētavā) uz 5 minūtēm, līdz šķīdums mainās no duļķaina uz dzidru un caurspīdīgu (vai nekustīgu).nedaudz duļķains) un laiku pa laikam vairākas reizes samaisa.
Δ Pēc Endotoksīna savācēja pievienošanas supernatantam supernatants kļūs duļķains, betsupernatantam jākļūst dzidram (vai nedaudz duļķainam) pēc atdzesēšanas ledus vannā.
6. Pēc tam, kad supernatants ir novietots istabas temperatūrā (>25℃) uz 10–15 minūtēm, tas kļūs duļķains.tā temperatūra paaugstinās līdz istabas temperatūrai.Pēc tam supernatants jāapgriež otrādi, lai sajauktos.
Δ Ja istabas temperatūra ir zemāka vai vēlaties samazināt ekstrakcijas laiku, supernatantu var inkubēt 37 ~ 42 ℃ ūdens vannā 5 - 10 minūtes un nākamo darbību var veikt pēc supernatanta.kļūst duļķains.
7. Centrifugējiet supernatantu ar aptuveni 11 000 apgr./min (12 000 × g) 10 minūtes istabas temperatūrā (temperatūrai jābūt > 25 ℃), lai atdalītu fāzi.Augšējā ūdens fāze satur DNS, bet apakšējā zilā eļļainā fāze satur endotoksīnu un citus piemaisījumus.PārsūtietDNS saturoša ūdens fāze uz jaunu cauruli unizmetiet taukaino slāni.
Δ Temperatūrai centrifugēšanas laikā jābūt virs 25 ℃, jo efektīva fāzu atdalīšana to nedararodas, ja temperatūra ir pārāk zema.
Δ Ja fāzu atdalīšana nav efektīva, centrifugēšanas temperatūru var noregulēt uz 30 ℃ uncentrifugēšanas laiku var palielināt līdz 15 min.
Δ Nesūc zilo taukaino slāni, jo tas satur endotoksīnu un citus piemaisījumus.
Mehānisms
Atkārtotas suspensijas līzes neitralizācija
◇ Pievienojiet 7,5 ml buferšķīduma P1
◇ Pievienojiet 7,5 ml buferšķīduma P2
◇ Pievienojiet 7,5 ml buferšķīduma P4
Endotoksīnu noņemšana
◇ Pievienojiet 0, 1 reizi lielāku Endotoxin Scavenger supernatanta tilpumu
Iesiešana un mazgāšana
◇ Pievienojiet 0,5 reizes lielāku izopropanola tilpumu
◇ Pievienojiet 10 ml buferšķīduma PW
◇ Pievienojiet 10 ml buferšķīduma PW
Elucija
◇ Pievienojiet 1–2 ml TB buferšķīduma vai endotoksīnu nesaturoša ddH2O
