Hotstart Taq DNS polimerāze
Hot Start Taq DNS polimerāze (antivielu modifikācija) ir karstās palaišanas termostabila DNS polimerāze no Thermus aquaticus YT-1, kam piemīt 5′→3′ polimerāzes aktivitāte un 5′ atloka endonukleāzes aktivitāte.Karstās palaišanas Taq DNS polimerāze ir Taq DNS polimerāze, ko modificē termolabīlās Taq antivielas.Antivielu modifikācija palielināja PCR specifiku, jutīgumu un iznākumu.
Sastāvdaļas
| Komponents | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5 × HC Taq buferis | 4 × 1 ml | 4 × 10 ml | 4 × 50 ml | 5 × 400 ml |
| Hot Start Taq DNS polimerāze (modificēta antiviela) (5 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 10 × 5 ml |
Lietojumprogrammas
10 mM Tris-HCl (pH 7,4 pie 25 ℃), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitola, 0,5% Tween20, 0,5% IGEPALCA-630 un 50% glicerīna.
Uzglabāšanas stāvoklis
Transportēšana zem 0°C un jāuzglabā -25°C~-15°C.
Vienības definīcija
Viena vienība ir definēta kā fermenta daudzums, kas 30 minūtēs 75°C temperatūrā iekļauj 15 nmol dNTP skābē nešķīstošā materiālā.
Kvalitātes kontrole
1.Endonuclease aktivitāte:Inkubējot 20 U enzīma ar 4 μg pUC19 DNS 4 stundas 37 ℃ temperatūrā, netika konstatēta DNS noārdīšanās, kā noteikts ar gēla elektroforēzi.
2.5 kb Lambda PCR:25 5 ng Lambda DNS PCR amplifikācijas cikli ar 1,25 Taq DNS polimerāzes vienībām 200 µM dNTP un 0,2 µM primeru klātbūtnē rada paredzamo 5 kb produktu.
3.Eksonukleāzes aktivitāte:Inkubējot 50 µl reakciju, kas satur vismaz 12,5 U Taq DNS polimerāzes ar 10 nmol 5'-FAM oligonukleotīdu, 30 minūtes 37 ℃ temperatūrā nenosakāmu sadalīšanos.
4.RNāzes aktivitāte:Inkubējot 10 µL reakciju, kas satur 20 U enzīma, ar 1 μg RNS transkriptiem 2 stundas 37 °C temperatūrā, netika konstatēta RNS noārdīšanās, kā noteikts ar gēla elektroforēzi.
5.Siltuma inaktivācija:Nē.
Reakcijas sistēma
| Sastāvdaļas | Skaļums |
| Veidnes DNSa | neobligāti |
| 10 μM Forward Primer | 0,5 μL |
| 10 μM reversais gruntējums | 0,5 μL |
| dNTP maisījums (katrs 10 mM) | 0,5 μL |
| 5 × HC Taq buferis | 5 μL |
| Taq DNS polimerāzeb(5 U/μL) | 0,125 μl |
| Ūdens bez kodola | Līdz 25 μL |
Piezīmes:
1) a.
| DNS | Summa |
| Genomisks | 1 ng-1 μg |
| Plazmīda vai vīrusu | 1 pg-1 ng |
2) b.Taq DNS polimerāzes optimālā koncentrācija specializētos lietojumos var svārstīties no 5-50 vienībām/ml (reakcija 0,1-0,5 vienības/25 µL).
Termiskā riteņbraukšanas protokols
PCR
| Solis | Temperatūra(°C) | Laiks | Cikli |
| Sākotnējā denaturācijaa | 95 ℃ | 1-3 minūtes | - |
| Denaturācija | 95 ℃ | 15-30 s | 30-35 cikli |
| Atkausēšanab | 45-68 ℃ | 15-60 s | |
| Pagarinājums | 68 ℃ | 1kb/min | |
| Pēdējais pagarinājums | 68 ℃ | 5 min | - |
Piezīmes:
1) Vairumam pastiprinājumu pietiek ar sākotnējo denaturāciju 1 min 95°C.Sarežģītām veidnēm ir ieteicama ilgāka denaturācija 2–3 minūtes 95°C temperatūrā.Izmantojot koloniju PCR, ieteicama sākotnējā 5 minūšu denaturācija 95 °C temperatūrā.
2) Atkausēšanas posms parasti ir 15–60 s.Rūdīšanas temperatūra ir balstīta uz gruntskrāsu pāra Tm un parasti ir 45-68 ℃.
