Uracila DNS glikozilāze
Uracil-DNS glikozilāze (UNG vai UDG) ir rekombinants E.coli klons ar molekulmasu 25 kDa.Tas katalizē brīvā uracila izdalīšanos no uracilu saturošas vienpavedienu un divpavedienu DNS, ir neaktīvs pret RNS, un to var izmantot, lai novērstu PCR amplifikācijas produktu piesārņojumu.Darbības princips ir balstīts uz to, ka, ja PCR reakcijā dTTP tiek aizstāts ar dUTP un veidojas PCR amplifikācijas produkts, kas satur dU bāzes, ferments var selektīvi salauzt U bāzu glikozīdu saiti vienpavedienu un divpavedienu. DNS un degradē PCR amplifikācijas produktu.
Ieteicamais pielietojums
Piesārņojuma novēršanas pastiprināšana
Uzglabāšanas stāvoklis
-20°C ilgstošai uzglabāšanai, pirms lietošanas labi jāsamaisa, izvairieties no biežas sasaldēšanas-atkausēšanas.
Uzglabāšanas buferis
20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, stabilizators, 50% glicerīns.
Vienības definīcija
Enzīma daudzums, kas nepieciešams, lai noārdītu 1 µg vienpavedienu DNS, kas satur dU bāzes, 1 stundas laikā 37°C temperatūrā ir 1 vienība.
Kvalitātes kontrole
1.SDS-PAGE elektroforētiskā tīrība ir lielāka par 98%
2.Pastiprināšanas jutība, partiju kontrole, stabilitāte
3.Pēc tam, kad 1 U UNG ir apstrādāts 50 ℃ 2 minūtes, veidnei, kas satur U zem 103 kopijām, vajadzētu pilnībā noārdīties un nevar izveidot pastiprināšanas produktu.
4.Nav eksogēnas nukleāzes aktivitātes
Instrukcijas
| Sastāvdaļas | Tilpums (μL) | Galīgā koncentrācija |
| 10 × PCR buferis (bez dNTP, Mg²+bezmaksas) | 5 | 1× |
| dUTP (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (aizstāt dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0.25 | 1,25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1–0,5) |
| 25 × Primer Mixa | 2 | 1× |
| Veidne | - | ＜1μg/reakcija |
| ddH₂O | Līdz 50 | - |
Piezīme: a: Ja to izmanto qPCR/qRT-PCR, fluorescējošā zonde jāpievieno reakcijas sistēmai.Parasti 0,2 μM galīgā grunts koncentrācija var dot labus rezultātus;ja reakcija ir slikta, praimera koncentrāciju var regulēt diapazonā no 0,2 līdz 1 μM.Parasti zondes koncentrācija tiek optimizēta diapazonā no 0,1 līdz 0,3 μM.Koncentrācijas gradienta eksperimentus var veikt, lai atrastu labāko grunts un zondes kombināciju.
Piezīmes
1.UNG enzīmu var izmantot, lai noņemtu piesārņotos dUTP amplifikācijas produktus no reakcijas sistēmas pirms PCR amplifikācijas reakcijas, pēc tam lai izvairītos no kļūdaini pozitīviem rezultātiem produkta piesārņojuma dēļ.
2.Optimālā temperatūra UNG enzīmam, ko izmantot pretpiesārņojuma PCR reakcijā, parasti ir 50 ℃ 2 minūtes;inaktivācijas nosacījums ir 95 ℃ 5 minūtes.
3.Izvairieties no biežas sasaldēšanas-atkausēšanas un nepakļaujiet lielām temperatūras svārstībām.
4.Dažādiem pastiprināmajiem gēniem ir atšķirīga dUTP izmantošanas efektivitāte un jutība pret UNG enzīmu, tādēļ, ja UNG sistēmas izmantošana noved pie detektēšanas jutības samazināšanās, reakcijas sistēma ir jāpielāgo un jāoptimizē, ja nepieciešams tehniskais atbalsts, lūdzu, sazinieties ar mūsu kompānija.
