RTL reversā transkriptāze
RTL reversā transkriptāze ir no RNS šablona atkarīga DNS polimerāze, kurai trūkst 3'→5' eksonukleāzes aktivitātes un kurai ir RNāzes H aktivitāte.Šis ferments var izmantot RNS kā veidni, lai sintezētu komplementāru DNS virkni, ko var izmantot pirmās virknes cDNS sintēzei, īpaši RT-LAMP (cilpas mediētā izotermiskā amplifikācija).Salīdzinot ar RTL reverso transkriptāzi 1.0, jutība ir ievērojami uzlabota, termiskā stabilitāte ir spēcīgāka un reakcija 65 ° C temperatūrā ir stabilāka.RTL reverso transkriptāzi (bez glicerīna) var izmantot, lai sagatavotu liofilizētus preparātus, liofilizētus RT-LAMP reaģentus utt.
Vienības definīcija
Viena vienība iekļauj 1 nmol dTTP ar skābi nogulsnējamā materiālā 20 minūšu laikā 50°C temperatūrā, izmantojot poli(A)•oligo(dT)25 kā šablona grunti.
Sastāvdaļas
| Komponents | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL reversā transkriptāze (bez glicerīna) (15 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10 × HC RTL buferis | 1,5 ml | 4 × 1,5 ml | 5 × 10 ml |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 ml | 2 × 1,5 ml | 3 × 10 ml |
Uzglabāšanas stāvoklis
Transportēšana zem 0°C un jāuzglabā -25°C~-15°C.
Kvalitātes kontrole
- Atlikušā aktivitāteEndonukleāze:50 μL reakcija, kas satur 1 μg λDNS un 15 vienības RTL2.0, kas inkubēta 16 stundas 37 ℃, parāda tādu pašu modeli kā negatīvā kontrole ar gēla elektroforēzi.
- Atlikušā aktivitāteEksonukleāze:50 μL reakcija, kas satur 1 μg HindⅢ sagremotas λDNS un 15 vienības RTL2.0, kas inkubēta 16 stundas 37 ℃ temperatūrā, parāda tādu pašu modeli kā negatīvā kontrole ar gēla elektroforēzi.
- Atlikušā aktivitāteNikase:50 μL reakcija, kas satur 1 μg superspirēta pBR322 un 15 vienības RTL2.0, kas inkubēta 4 stundas 37 °C temperatūrā, parāda tādu pašu modeli kā negatīvā kontrole ar gēla elektroforēzi.
- Atlikušā aktivitāteRNāze:10 μL reakcija, kas satur 0,48 μg MS2 RNS un 15 vienības RTL2.0, kas inkubēta 4 stundas 37 °C temperatūrā, parāda tādu pašu modeli kā negatīvā kontrole ar gēla elektroforēzi.
- E. coli gDNS:Mērīts arE.colispecifiski HCD noteikšanas komplekti, 15 RTL2.0 vienības satur mazāk nekā 1E. coligenoms.
Reakcijas iestatīšana
cDNS sintēzes protokols
| Sastāvdaļas | Skaļums |
| Veidnes RNS a | neobligāti |
| Oligo(dT) 18-25 (50 uM) vai Random Primer maisījums (60 uM) | 2 μL |
| dNTP maisījums (katrs 10 mM) | 1 μL |
| RNāzes inhibitors (40 U/ul) | 0,5 μL |
| RTL reversā transkriptāze 2.0 (15 U/uL) | 0,5 μL |
| 10 × HC RTL buferis | 2 μL |
| Ūdens bez kodola | Līdz 20 μL |
Piezīmes:
1) Ieteicamā kopējās RNS deva ir 1ng ~ 1μg
2) Ieteicamā mRNS deva bija 50 ng ~ 100 ng
Termo-riteņbraukšana Nosacījumi rutīnai reakcija:
| Temperatūra (°C) | Laiks |
| 25 °Ca | 5 min |
| 55 °C | 10 minūtesb |
| 80 °C | 10 minūtes |
Piezīmes:
1) Ja tiek izmantots Random Primer Mix, inkubējiet 25°C temperatūrā.
2) Ja tiek izmantots mērķa grunts maisījums, inkubējiet 55°C temperatūrā 10–30 minūtes.
RT-LAMP protokols
| Sastāvdaļas | Skaļums | Galīgā koncentrācija |
| Veidnes RNS | neobligāti | ≥10 kopijas |
| dNTP maisījums (10 mM) | 3,5 μL | 1,4 mM |
| FIP/BIP grunti (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| F3/B3 grunti (25 ×) | 1 μL | 0,2 μM |
| LoopF/LoopB grunti (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| RNāzes inhibitors (40 U/μL) | 0,5 μL | 20 U / reakcija |
| RTL reversā transkriptāze 2.0 (15 U/μL) | 0,5 μL | 7,5 U/reakcija |
| Bst V2 DNS polimerāze (8 U/μL) | 1 μL | 8 U/Reakcija |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μL | 6 mM (kopā 8 mM) |
| 10 × HC RTL buferis (vai 10 × HC Bst V2 buferis) | 2,5 μL | 1 × (2 mM Mg2+) |
| Ūdens bez kodola | Līdz 25 μL | - |
Piezīmes:
1) Sajauc, vorteksot, un īsi centrifugē, lai savāktu.Inkubācija pastāvīgā temperatūrā 65°C 1 stundu.
2) Abi buferi ir sadarbspējīgi un tiem ir vienāds sastāvs.
Piezīmes
1. Uzglabājot -20 °C temperatūrā, šis produkts veidos baltu cietu vielu.Izņem no -20°C un liek uz ledus uz aptuveni 10 minūtēm.Pēc kausēšanas to var lietot, kratot un samaisot.
2. cDNS produktu var uzglabāt -20°C vai -80°C vai nekavējoties izmantot PCR reakcijai.
3.Lai novērstu RNāzes piesārņojumu, lūdzu, saglabājiet eksperimentālo zonu tīru un darbības laikā valkājiet tīrus cimdus un maskas.
