Proteināze K (šķidrums)
Kaķa Nr.: HC4502A
Proteināze K ir stabila serīna proteāze ar plašu substrāta specifiku.Tas noārda daudzus proteīnus sākotnējā stāvoklī pat mazgāšanas līdzekļu klātbūtnē.Pierādījumi no kristāla un molekulārās struktūras pētījumiem liecina, ka enzīms pieder subtilizīnu saimei ar aktīvās vietas katalītisko triādi (Asp39-Viņa69- Ser224).Dominējošā šķelšanās vieta ir peptīdu saite, kas atrodas blakus alifātisko un aromātisko aminoskābju karboksilgrupai ar bloķētām alfa aminogrupām.To parasti izmanto tā plašā nozīmēspecifika.
Specifikācija
| Izskats | Bezkrāsains līdz gaiši brūns šķidrums |
| Aktivitāte | ≥800 V/ml |
| Olbaltumvielu koncentrācija | ≥20 mg/ml |
| DNSāze | Neviens nav konstatēts |
| RNāze | Neviens nav konstatēts |
Uzglabāšanas apstākļi
Uzglabāt 2-8℃ temperatūrā.
Īpašības
| EK numurs | 3.4.21.64 (Rekombinants no albuma Tritirachium) |
| Molekulārais svars | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Izoelektriskais punkts | 7.81 |
| Optimālais pH | 7,0-12,0 1. att |
| Optimāla temperatūra | 65 ℃ 2. att |
| pH stabilitāte | pH 4,5-12,5 (25℃, 16 h) 3. att |
| Termiskā stabilitāte | Zem 50℃ (pH 8,0, 30 min) 4. att |
| Aktivatori | SDS, urīnviela |
| Inhibitori | diizopropilfluorfosfāts;fenilmetilsulfonilfluorīds |
Lietojumprogrammas
1. Ģenētiskās diagnostikas komplekts
2. RNS un DNS ekstrakcijas komplekti
3. Neolbaltumvielu komponentu ekstrakcija no audiem, olbaltumvielu piemaisījumu, piemēram, DNS vakcīnu, noārdīšana un heparīna sagatavošana
4. Hromosomu DNS sagatavošana ar impulsa elektroforēzi
5. Western blot
6. Enzīmu glikozilētā albumīna reaģentu in vitro diagnostika
Piesardzības pasākumi
Lietojot vai sverot, valkājiet aizsargcimdus un aizsargbrilles, un pēc lietošanas uzglabājiet labu ventilāciju.Šis produkts var izraisīt ādas alerģisku reakciju un nopietnu acu kairinājumu.Ja ieelpots, tas var izraisīt alerģiju vai astmas simptomus vai aizdusu.Var izraisīt elpceļu kairinājumu.
Pārbaude
Vienības definīcija
Viena vienība (U) ir definēta kā fermenta daudzums, kas nepieciešams, lai hidrolizētu kazeīnu, lai ražotu 1 μmol tirozīna minūtē šādos apstākļos.
Reaģentu sagatavošana
Reaģents I: 1 g piena kazeīna tika izšķīdināts 50 ml 0,1 M nātrija fosfāta šķīduma (pH 8,0), inkubēts 65-70 ℃ ūdenī 15 minūtes, maisīts un izšķīdināts, atdzesēts ar ūdeni, noregulēts ar nātrija hidroksīdu līdz pH 8,0 un fiksēts. tilpums 100ml.
Reaģents II: TCA šķīdums: 0,1 M trihloretiķskābe, 0,2 M nātrija acetāts, 0,3 M etiķskābe.
Reaģents III: 0,4 M Na2CO3risinājums.
Reaģents IV: Fortu reaģents, kas 5 reizes atšķaidīts ar tīru ūdeni.
Reaģents V: Enzīmu šķīdinātājs: 0,1 M nātrija fosfāta šķīdums (pH 8,0).
Reaģents VI: tirozīna šķīdums: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tirozīns, kas izšķīdināts ar 0,2 M HCl.
Procedūra
1. 0,5 ml reaģenta I iepriekš uzsilda līdz 37 ℃, pievieno 0,5 ml enzīma šķīduma, labi samaisa un inkubē 37 ℃ 10 minūtes.
2. Pievienojiet 1 ml reaģenta II, lai apturētu reakciju, labi samaisiet un turpiniet inkubēt 30 minūtes.
3. Centrifugējiet reakcijas šķīdumu.
4. Paņemiet 0,5 ml supernatanta, pievienojiet 2,5 ml reaģenta III, 0,5 ml reaģenta IV, labi samaisiet un inkubējiet 37 ℃ 30 minūtes.
5. OD660tika noteikts kā OD1;tukšā kontroles grupa: 0,5 ml reaģenta V izmanto, lai aizstātu enzīma šķīdumu, lai noteiktu OD660kā OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. L-tirozīna standarta līkne: 0,5 ml dažādas koncentrācijas L-tirozīna šķīduma, 2,5 ml reaģenta III, 0,5 ml reaģenta IV 5 ml centrifūgas mēģenē, inkubēt 37 ℃ 30 minūtes, noteikt OD660dažādām L-tirozīna koncentrācijām, iegūst standarta līkni Y=kX+b, kur Y ir L-tirozīna koncentrācija, X ir OD600.
Aprēķins
2: kopējais reakcijas šķīduma tilpums (ml)
0,5: fermenta šķīduma tilpums (ml)
0,5: hromogēnajā noteikšanā izmantotais reakcijas šķidruma tilpums (ml)
10: reakcijas laiks (min)
Df: Atšķaidīšanas daudzkārtējs
C: Enzīmu koncentrācija (mg/ml)
Atsauces
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.Commun.(1971);44:513.
3. Hilzs, H.un citi.,Eiro.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambruks Džet al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. izdevums, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Skaitļi
att. 1 Optimāls pH
100mM buferšķīdums: pH6,0-8,0, Na-fosfāts;pH 8,0-9,0, Tris-HCl;pH 9,0-12,5, Glicīns-NaOH. Fermentu koncentrācija: 1mg/mL
2. att. Optimālā temperatūra
Reakcija 20 mM K-fosfāta buferšķīdumā pH 8,0.Fermentu koncentrācija: 1mg/ml
3. att. pH Stabilitāte
25℃,16 h-apstrāde ar 50mM buferšķīdumu: pH 4,5-5,5, Acetāts;pH 6,0-8,0, Na-fosfāts;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, Glicīns-NaOH.Fermentu koncentrācija: 1mg/ml
4. att. Termiskā stabilitāte
30 min apstrāde ar 50 mM Tris-HCl buferšķīdumu, pH 8,0.Fermentu koncentrācija: 1mg/ml
5. att. Uzglabāšana stability at 25℃
