M-MLV Neoskripta reversā transkriptāze
Neoscript Reverse Transcriptase ir reversā transkriptāze, kas iegūta, pārbaudot Moloney peles leikēmijas vīrusa izcelsmes M-MLV gēna mutāciju un ekspresiju E.coli.Ferments noņem RNāzes H aktivitāti, tam ir augstāka temperatūras tolerance, un tas ir piemērots reversai transkripcijai augstā temperatūrā.Tāpēc tas ir noderīgs, lai novērstu RNS augsta līmeņa struktūras un nespecifisku faktoru nelabvēlīgo ietekmi uz cDNS sintēzi, un tam ir augstāka stabilitāte un reversās transkripcijas sintēzes spēja.Fermentam ir augstāka stabilitāte un reversās transkripcijas sintēzes spēja.
Sastāvdaļas
1.200 U/μL Neoskripta reversā transkriptāze
2.5 × pirmās daļas buferis (pēc izvēles)
* 5 × First-Strand buferis nesatur dNTP, lūdzu, pievienojiet dNTP, gatavojot reakcijas sistēmu
Ieteicamais pielietojums
1.Vienpakāpes qRT-PCR.
2.RNS vīrusa noteikšana.
Uzglabāšanas stāvoklis
-20°C ilgstošai uzglabāšanai, pirms lietošanas labi jāsamaisa, izvairieties no biežas sasaldēšanas-atkausēšanas.
Vienības definīcija
Viena vienība satur 1 nmol dTTP 10 minūtēs 37°C temperatūrā, izmantojot poli(A)•oligo(dT)25kā veidne/grunts.
Kvalitātes kontrole
1.SDS-PAGE elektroforētiskā tīrība ir lielāka par 98%.
2.Pastiprināšanas jutība, partiju kontrole, stabilitāte.
3.Nav eksogēnas nukleāzes aktivitātes, nav eksogēnas endonukleāzes vai eksonukleāzes piesārņojuma
Pirmās ķēdes reakcijas risinājuma reakcijas iestatīšana
1.Reakcijas maisījuma sagatavošana
| Sastāvdaļas | Skaļums |
| Oligo (dT)12-18 Primer vai Random Primera Vai gēnu specifiskie gruntib | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Veidnes RNS | Kopējā RNS≤ 5μg;mRNS≤ 1 μg |
| RNāzes nesaturošs dH2O | Līdz 10 μl |
Piezīmes:a/b: lūdzu, izvēlieties dažādu veidu gruntējumu atbilstoši savām eksperimentālajām vajadzībām.
2.Karsējiet 65°C 5 minūtes un ātri atdzesējiet uz ledus 2 minūtes.
3.Pievienojiet iepriekšminētajai sistēmai šādus komponentus līdz 20 µL un uzmanīgi samaisiet:
| Sastāvdaļas | Sējums (μL) |
| 5 × pirmās daļas buferis | 4 |
| Neoscript reversā transkriptāze (200 U/μL) | 1 |
| RNāzes inhibitors (40 V/μl) | 1 |
| RNāzes nesaturošs dH2O | Līdz 20 μL |
4.Lūdzu, veiciet reakciju saskaņā ar šādiem nosacījumiem:
(1) Ja tiek izmantots Random Primer, reakcija jāveic 25 ℃ 10 minūtes un pēc tam 50 ℃ 30 ~ 60 minūtes;
(2) Ja izmanto Oligo dT vai specifiskus primerus, reakcija jāveic 50 ℃ temperatūrā 30–60 minūtes.
5.Karsējiet 95 ℃ 5 minūtes, lai inaktivētu Neoscript reverso transkriptāzi un pārtrauktu reakciju.
6.Reversās transkripcijas produktus var izmantot tieši PCR reakcijā un fluorescences kvantitatīvajā PCR reakcijā vai ilgstoši uzglabāt -20 ℃ temperatūrā.
PCR Rdarbība:
1.Reakcijas maisījuma sagatavošana
| Sastāvdaļas | Koncentrēšanās |
| 10 × PCR buferis (bez dNTP, bez Mg²+) | 1× |
| dNTP (10 mM katrs dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNS polimerāze (5 U/μL) | 2-2,5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Veidnea | ≤10% pirmās ķēdes reakcijas šķīdums (2 μL) |
| ddH2O | Līdz 50 μL |
Piezīmes:a: Ja tiek pievienots pārāk daudz pirmās ķēdes reakcijas šķīduma, PCR reakcija var tikt kavēta.
2.PCR reakcijas procedūra
| Solis | Temperatūra | Laiks | Cikli |
| Iepriekšēja denaturācija | 95℃ | 2-5 min | 1 |
| Denaturācija | 95℃ | 10-20 sek | 30-40 |
| Atkausēšana | 50-60 ℃ | 10-30 sek | |
| Pagarinājums | 72℃ | 10-60 sek |
Piezīmes
1.Piemērots reversās transkripcijas temperatūras optimizācijai diapazonā no 42 ℃ ~ 55 ℃.
2.Tam ir labāka stabilitāte, tas ir piemērots augstas temperatūras reversās transkripcijas pastiprināšanai.Turklāt tas ir labvēlīgs, lai efektīvi izietu cauri sarežģītiem RNS strukturālajiem reģioniem.Arī tasir piemērots vienpakāpes multipleksas fluorescences kvantitatīvai RT-PCR noteikšanai.
3.Laba savietojamība ar dažādiem PCR amplifikācijas enzīmiem un ir piemērota augstas jutības RT-PCR reakcijām.
4.Piemērots augstas jutības vienpakāpes fluorescences kvantitatīvai RT-PCR reakcijai, efektīvi uzlabo zemas veidņu koncentrācijas noteikšanas ātrumu.
5.Piemērots cDNS bibliotēkas veidošanai.
