DNS ekstrakcijas mini komplekts
Šajā komplektā ir izmantota optimizēta bufersistēma un silikagēla kolonnas attīrīšanas tehnoloģija, kas var atgūt 70 bp – 20 kb DNS fragmentus no dažādu koncentrāciju TAE vai TBE agarozes gela.DNS adsorbcijas kolonna var īpaši adsorbēt DNS augsta sāls satura apstākļos.Turklāt komplekts var tieši attīrīt DNS fragmentus no PCR produktiem, enzīmu reakciju sistēmām vai neapstrādātiem DNS produktiem, kas iegūti ar citām metodēm, un noņemt piemaisījumus, piemēram, olbaltumvielas, citus organiskos savienojumus, neorganisko sāļu jonus un oligonukleotīdu praimerus.Tas var nodrošināt, ka attīrīšanu var pabeigt 10-15 minūšu laikā.Attīrīto DNS var tieši izmantot ligēšanai, transformācijai, fermentu šķelšanai, in vitro transkripcijai, PCR, sekvencēšanai, mikroinjekcijai utt.
Uzglabāšanas apstākļi
Uzglabāt -15 ~ -25 ℃ un transportēt istabas temperatūrā.
Sastāvdaļas
| Sastāvdaļas | (100 rxns) |
| Bufera IKP | 80 ml |
| Buferis GW | 2 × 20 ml |
| Elucijas buferis | 20 ml |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
Bufera IKP:DNS saistošs buferis.
Buferis GW:Mazgāšanas buferis;pirms lietošanas pievienojiet absolūto etanolu uz pudeles norādītajā tilpumā.
Elucijas buferis:Elucija.
FastPure DNS Mini Columns-G:DNS adsorbcijas kolonnas.
Savākšanas tūbiņas 2 ml:Savākšanas caurules filtrātam.
Sagatavotie materiāli
1,5 ml sterilizētas mēģenes, absolūtais etanols un izopropanols (ja DNS fragments ≤100 bp, pievieno 1 tilpumu
izopropanolu līdz 1 tilpuma gēlam), ūdens vannā.
Eksperimenta process
Pirms lietošanas pievienojiet 80 ml etanola, lai atšķaidītu buferšķīdumu GW, kā norādīts uz etiķetes, un uzglabāt istabas temperatūrā.
Mehānisms
1. PCR reakcijas šķīdums
Gēla ekstrakcijas shēma: pievienojiet vienāda tilpuma buferšķīduma GDP PCR reakcijas šķīduma atgūšanas shēmu:Pievienojiet 5 reizes lielāku tilpuma buferi
2. IKP Aprēķiniet želejas tilpumu (100 μl ir vienāds ar 100 mg)
Izšķīdiniet želeju
3. Uzkarsē uz 50 ~ 55 grādiem℃
4. Bind Wash
Pievienojiet 300 μL bufera IKP*
Pievienojiet 700 μL buferšķīduma GW
Pievienojiet 700 μL buferšķīduma GW
5. Elute
Pievienojiet 20–30 μL eluēšanas buferšķīduma vai dejonizēta ūdens
Piezīmes* PCR reakcijas šķidruma atgūšana bez šī posma
Gēla ekstrakcijas programma
1. Pēc DNS elektroforēzes DNS fragmentu frakcionēšanai UV gaismā no agarozes gēla izgrieziet atsevišķu DNS fragmenta joslu.Ieteicams izmantot absorbējošu papīru, lai absorbētu šķietamo želejas mitrumu un samazinātu želejas šķēles izmēru, pēc iespējas noņemot papildu agarozi.Nosveriet gēla šķēli (bez mikrocentrifūgas caurules), lai aprēķinātu tās tilpumu: 100 mg gēla šķēles tilpums ir aptuveni 100 μL, pieņemot, ka blīvums ir 1 g/ml.
2. Pievienojiet vienādu tilpumu buferšķīduma GDP, inkubējiet 50-55 ℃ 7-10 minūtes (atbilstoši gēla izmēram noregulējiet inkubācijas laiku, līdz gēls ir pilnībā izšķīdis).Inkubācijas laikā mēģeni 2 reizes apgrieziet otrādi.
Δ Bufera IKP 1-3 tilpumu pievienošana neietekmēs DNS atgūšanas efektivitāti.Ja atgūstamais DNS fragments <100 bp, jāpievieno 3 tilpumi buferšķīduma GDP;kad gēla šķēle ir pilnībā izšķīdusi, pievienojiet 1 tilpumu izopropanola un rūpīgi samaisiet, pēc tam turpiniet ar nākamo soli.
3. Īsi centrifugējiet, lai paraugs nonāktu mēģenes apakšā, ievietojiet FastPure DNA Mini Columns-G savākšanas mēģenēs 2 ml, uzmanīgi pārnesiet šķīdumu ne vairāk kā 700 μL vienu reizi
laiku līdz filtrēšanas kolonnām, centrifugējiet pie 12 000 apgr./min (13 800 X g) 30-60 sekundes.
4. Izmetiet filtrātu un pievienojiet kolonnai 300 μL buferšķīduma GDP, inkubējiet istabas temperatūrā 1 minūti, centrifugējiet pie 12 000 apgr./min (13 800 X g) 30-60 sekundes.
5. Izmetiet filtrātu un pievienojiet 700 μL buferšķīduma GW (pārbaudiet, vai iepriekš ir pievienots absolūtais etanols!), centrifugējiet ar ātrumu 12 000 apgr./min (13 800 X g) 30-60 sekundes.
Δ Lūdzu, pievienojiet buferšķīdumu GW ap adsorbcijas kolonnas sienu vai pievienojiet Buffer GW aizmugurējo vāciņu un samaisiet to otrādi 2–3 reizes, lai palīdzētu pilnībā izskalot sāli, kas pielipusi pie caurules sienas.
6. Atkārtojiet 5. darbību.
Δ Skalošana ar buferšķīdumu GW divreiz var nodrošināt, ka sāls tiek pilnībā noņemts un novērst ietekmi uz turpmākajiem eksperimentiem.
7. Izmetiet filtrātu un centrifugējiet tukšo kolonnu ar ātrumu 12 000 apgr./min (13 800 X g) 2 minūtes.
8. Ievietojiet kolonnu tīrā 1,5 ml mikrocentrifūgas mēģenē, pievienojiet 20–30 μL eluēšanas bufera kolonnas membrānas centrā, inkubējiet 2 minūtes un pēc tam centrifugējiet ar ātrumu 12 000 apgr./min (13 800 X g) 1 minūti.Izmetiet kolonnu, uzglabājiet iegūto DNS -20 °C temperatūrā.
Δ 8. darbības supernatanta pārvietošana uz kolonnu, lai to atkal eluētu, un eluēšanas bufera iepriekšēja uzsildīšana līdz 55 (ja DNS fragments >3 kb), var palīdzēt palielināt reģenerācijas efektivitāti.
PCR produktu atjaunošanas programma
Šis protokols ir piemērojams DNS fragmentu attīrīšanai no PCR produktiem, fermentatīvās reakcijas sistēmas un citiem DNS kopproduktiem (ieskaitot ģenētisko DNS).Šis šķīdums var efektīvi noņemt dažādus nukleotīdus, praimerus, praimeru dimērus, sāls molekulas, fermentus un citus piemaisījumus.
1. Īsi centrifugējiet PCR produktus, fermentatīvās reakcijas šķīdumu un citus DNS neapstrādātus produktus.Novērtējiet to tilpumu ar pipeti un pārnesiet sterilizētā 1,5 ml vai 2 ml mēģenē.Pievieno ddH2O līdz tilpumam līdz 100 μL;savukārt genoma DNS ar augstu koncentrāciju atšķaidīšana līdz 300 μL ar ddH2O palīdzēs uzlabot reģenerācijas efektivitāti.
2. Pievienojiet 5 tilpumus buferšķīduma GDP, rūpīgi samaisiet, apgriežot vai virpuļojot.Ja interesējošais DNS fragments >100 bp, jāpievieno papildu 1,5 tilpumi (paraugi + buferšķīdums IKP) etanola.
3. Ievietojiet kolonnu atpakaļ savākšanas mēģenē, pārnesiet maisījumu uz kolonnu, centrifugējiet ar ātrumu 12 000 apgr./min (13 800 × g) 30–60 sekundes.Ja sajauktā šķīduma tilpums ir >700 µL, ievietojiet adsorbcijas kolonnu atpakaļ savākšanas mēģenē, atlikušo šķīdumu pārnesiet uz adsorbcijas kolonnu un centrifugējiet ar ātrumu 12 000 apgr./min (13 800 × g) 30–60 sekundes.
4. Nākamā darbība attiecas uz 08-1/Gel ekstrakcijas programmas 5.–8. darbību.
Lietojumprogrammas
Dažādas koncentrācijas TAE vai TBE agarozes gēls;PCR produkti, enzīmu reakciju sistēmas vai citi neapstrādāti DNS produkti, kas iegūti ar dažādām metodēm.Atgūtie fragmenti svārstījās no70 bp - 20 kb.
Piezīmes
Izmantošanai tikai pētniecībā.Nav paredzēts lietošanai diagnostikas procedūrās.
1. Pirms lietošanas pievienojiet 80 ml etanola, lai atšķaidītu buferšķīdumu GW, kā norādīts uz etiķetes, uzglabājiet istabas temperatūrā.
2. Ja buferšķīdumu IKP ir viegli nogulsnēt zemas temperatūras uzglabāšanas laikā, pirms lietošanas to uz laiku var novietot istabas temperatūrā.Ja nepieciešams, to var uzkarsēt 37℃ ūdens vannā, līdz nogulsnes ir pilnībā izšķīdušas, un pēc tam to var izmantot pēc samaisīšanas.
3. Iepriekš iestatiet ūdens vannas temperatūru uz 50 ~ 55 ℃.
4. 08-1/Gel ekstrakcijas programmas 1. solī gēla šķēles izmēra samazināšana ievērojami samazinās šķīšanas laiku un palielinās reģenerācijas efektivitāti (linearizētā DNS ir viegli hidrolizējama, nepārtraukti pakļaujot to augstā temperatūrā).Nepakļaujiet DNS želeju ilgu laiku UV iedarbībai, jo ultravioletā gaisma var izraisīt DNS bojājumus.
5. Pilnībā izšķīdiniet želeju 08-1/Gel ekstrakcijas programmas 2. solī, pretējā gadījumā tiks nopietni ietekmēta DNS atgūšanas efektivitāte.
6. Uzsildiet eluēšanas buferi vai ddH2O līdz 55 ℃, kas palīdz uzlabot DNS eluēšanas efektivitāti.DNS ieteicams uzglabāt 2,5 mM Tris-HCl eluentā, pH 7,0 – 8,5.
