Vaccinia vīrusa ierobežojošais enzīms

Vaccinia vīrusa ierobežojošais enzīms ir iegūts no rekombinantā E. coli celma, kas satur Vaccinia ierobežojošā enzīma gēnus.Šis vienīgais enzīms sastāv no divām apakšvienībām (D1 un D12), un tam ir trīs enzīmu aktivitātes (RNS trifosfatāze un guanililtransferāze ar D1 apakšvienību un guanīna metiltransferāze ar D12 apakšvienību).Vaccinia virus Capping Enzyme ir efektīvs, lai katalizētu vāciņa struktūras veidošanos, kas var īpaši piestiprināt 7-metilguanilāta vāciņa struktūru (m7Gppp, Cap 0) RNS 5′ galam.Vāciņa struktūrai (Cap 0) ir svarīga loma mRNS stabilizēšanā, transportēšanā un translācijā eikariotos.RNS ierobežošana ar enzīmu reakciju ir efektīva un vienkārša metode, kas var ievērojami uzlabot RNS stabilitāti un translāciju in vitro transkripcijai, transfekcijai un mikroinjekcijai.

Sastāvdaļas

Vaccinia Virus Capping Enzyme (10 U/μL)

10 × ierobežošanas buferis

Uzglabāšanas apstākļi

-25～- 15℃ uzglabāšanai (Izvairieties no atkārtotiem sasaldēšanas-atkausēšanas cikliem)

Uzglabāšanas buferis

20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl,

1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50% glicerīna.

Vienības definīcija

Viena Vaccinia vīrusa ierobežojošā enzīma vienība ir definēta kā enzīma daudzums, kas nepieciešams, lai iekļautu 10 pmol GTP 80nt transkriptā 1 stundas laikā 37 °C temperatūrā.

Kvalitātes kontrole

Eksonukleāze:10 U Vaccinia vīrusa aizbāžņa enzīma ar 1 μg λ-Hind III sagremotas DNS 37 ℃ temperatūrā 16 stundas nenoārda, kā noteikts ar agarozes gēla elektroforēzi.

Endonukleāze:10 U Vaccinia vīrusa ierobežojošā enzīma ar 1 μg λDNS 37 ℃ temperatūrā 16 stundas nenoārda, kā noteikts ar agarozes gēla elektroforēzi.

Nikase:10 U Vaccinia vīrusu ierobežojošā enzīma ar 1 μg pBR322 37 ℃ temperatūrā 16 stundas nenoārda, kā noteikts ar agarozes gēla elektroforēzi.

RNāze:10 U Vaccinia vīrusa aizbāžņa enzīma ar 1,6 μg MS2 RNS 4 stundas 37 ℃ temperatūrā nenoārda, kā noteikts ar agarozes gēla elektroforēzi.

1.coli DNS:10 U Vaccinia virus Capping Enzyme tiek pārbaudīts, lai noteiktu E. coli genoma DNS klātbūtni, izmantojot TaqMan qPCR ar praimeriem, kas ir specifiski E. coli 16S rRNS lokusam.E. coli genoma DNS piesārņojums ir ≤1 E. coli genoms.

2.Baktēriju Endotoksīns: LAL tests, saskaņā ar Ķīnas Farmakopejas IV 2020. gada izdevumu, gēla limita testa metode, vispārīgs noteikums (1143).Baktēriju endotoksīnu saturam jābūt ≤10 EU/mg.

Reakcijas sistēma un apstākļi

1. Ierobežošanas protokols (reakcijas tilpums: 20 μL)

Šī procedūra ir piemērojama 10 μg RNS (≥100 nt) ierobežošanas reakcijai, un to var palielināt atbilstoši eksperimentālajām prasībām.

I) Apvienojiet 10 μg RNS un nukleāzi nesaturošu H2O 1,5 ml mikrofūgas mēģenē līdz galīgajam tilpumam 15,0 µL.*10 × noslēdzošais buferšķīdums: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT (25 ℃, pH 8,0)

2) Karsē 65 ℃ 5 minūtes, kam seko ledus vanna 5 minūtes.

3) Pievienojiet tālāk norādītās sastāvdaļas norādītajā secībā

*10 x noslēdzošais buferis: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT (25 ℃, pH 8,0)

4) Inkubējiet 37°C temperatūrā 30 minūtes, RNS tagad ir aizvākta un gatava turpmākai lietošanai.

2. 5′ terminālis marķēšanas reakcija (reakcijas apjoms: 20 μL)

Šis protokols ir paredzēts, lai marķētu RNS, kas satur 5' trifosfātu, un to var palielināt atbilstoši prasībām.Etiķetes iekļaušanas efektivitāti ietekmēs RNS: GTP molārā attiecība, kā arī GTP saturs RNS paraugos.

1) Apvienojiet atbilstošu daudzumu RNS un nukleāzi nesaturoša H2O 1,5 ml mikrofūgas mēģenē līdz galīgajam tilpumam 14,0 µL.

2) Karsē 65 ℃ 5 minūtes, kam seko ledus vanna 5 minūtes.

3) Pievienojiet tālāk norādītās sastāvdaļas norādītajā secībā.

** GTP MIX attiecas uz GTP un nelielu skaitu marķieru.Par GTP koncentrāciju skuz 3. piezīmi.

4) Inkubējiet 37°C temperatūrā 30 minūtes, RNS 5' gals tagad ir marķēts un gatavs lietošanai pa straumi.

Lietojumprogrammas

1. MRNS aizbāžņu noteikšana pirms translācijas pārbaudēm/in vitro translācijas

2. mRNS 5' gala marķēšana

Piezīmes par lietošanu

1.RNS šķīduma karsēšana pirms inkubācijas ar Vaccinia Capping Enzyme noņem sekundāro struktūru transkripta 5' galā.Pagariniet laiku līdz 60 minūtēm atšifrējumiem ar zināmiem augsti strukturētiem 5 galiem.

2. RNS, ko izmanto ierobežošanas reakcijās, pirms lietošanas jāattīra un suspendē ūdenī, kas nesatur nukleāzi.EDTA nedrīkst būt, un šķīdumā nedrīkst būt sāļu.

3. Lai marķētu 5' galu, kopējai GTP koncentrācijai jābūt aptuveni 1-3 reizes lielākai par mRNS molāro koncentrāciju reakcijā.

4. Reakcijas sistēmas tilpumu var palielināt vai samazināt atbilstoši faktiskajam.