PNGāze F
Peptīda-N-glikozidāze F (PNGase F) ir visefektīvākā fermentatīvā metode gandrīz visu ar N saistīto oligosaharīdu atdalīšanai no glikoproteīniem.PNGāze F ir amidāze, kas sadalās starp iekšējiem GlcNAc un asparagīna atlikumiem no augsta mannozes, hibrīda un komplekso oligosaharīdu no N-saistītiem glikoproteīniem.
Pieteikums
Šis ferments ir noderīgs ogļhidrātu atlieku noņemšanai no olbaltumvielām.
Sagatavošana un specifikācija
| Izskats | Bezkrāsains šķidrums |
| Olbaltumvielu tīrība | ≥95% (no SDS-PAGE) |
| Aktivitāte | ≥500 000 U/ml |
| Eksoglikozidāze | Nevarēja konstatēt nekādu darbību (ND) |
| Endoglikozidāze F1 | ND |
| Endoglikozidāze F2 | ND |
| Endoglikozidāze F3 | ND |
| Endoglikozidāze H | ND |
| Proteāze | ND |
Īpašības
| EK numurs | 3.5.1.52(Rekombinants no mikroorganismiem) |
| Molekulārais svars | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Izoelektriskais punkts | 8. 14 |
| Optimālais pH | 7,0-8,0 |
| Optimāla temperatūra | 65 °C |
| Substrāta specifika | Glikozīdu saišu sadalīšana starp GlcNAc un asparagīna atlikumiem 1. att. |
| Atpazīšanas vietnes | N-saistīti glikāni, ja vien tie nesatur α1-3 fukozi 2. att |
| Aktivatori | DTT |
| Inhibitors | SDS |
| Uzglabāšanas temperatūra | -25 ~ -15 ℃ |
| Siltuma inaktivācija | 20 µL reakcijas maisījumu, kas satur 1 µL PNGase F, inaktivē, inkubējot 75 °C 10 minūtes. |
1. att. PNGāzes F substrāta specifika
2. att. PNGāzes F atpazīšanas vietas.
Kad iekšējie GlcNAc atlikumi ir saistīti ar α1-3 fukozi, PNGāze F nevar atdalīt ar N saistītus oligosaharīdus no glikoproteīniem.Šī modifikācija ir izplatīta augiem un dažiem kukaiņu glikoproteīniem.
Coponenti
|
| Sastāvdaļas | Koncentrēšanās |
| 1 | PNGāze F | 50 µl |
| 2 | 10 × glikoproteīnu denaturējošs buferis | 1000 µl |
| 3 | 10 × GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Vienības definīcija
Viena vienība (U) ir definēta kā enzīma daudzums, kas nepieciešams, lai noņemtu >95% ogļhidrātu no 10 µg denaturētas RNāzes B 1 stundas laikā 37 °C temperatūrā 10 µL kopējā reakcijas tilpumā.
Reakcijas apstākļi
1.Izšķīdiniet 1–20 µg glikoproteīna ar dejonizētu ūdeni, pievienojiet 1 µl 10 × glikoproteīna denaturēšanas buferšķīduma un H2O (ja nepieciešams), lai kopējais reakcijas tilpums būtu 10 µl.
2.Inkubējiet 100°C 10 minūtes, atdzesējiet uz ledus.
3.Pievienojiet 2 µl 10 × GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 un samaisiet.
4.Pievienojiet 1–2 µl PNGāzes F un H2O (ja nepieciešams), lai izveidotu 20 µl kopējo reakcijas tilpumu un samaisītu.
5.Inkubējiet reakciju 37 °C temperatūrā 60 minūtes.
6.SDS-PAGE analīzei vai HPLC analīzei.
