mRNS Cap2'-O-metiltransferāze

mRNS Cap 2' -O-metiltransferāze tika iegūta no rekombinantā E. coli celma, kas satur vaccinia mRNS Cap 2 '-O-metiltransferāzes gēnu.Šis enzīms pievieno metilgrupu pirmā nukleotīda 2'-O pozīcijā, kas atrodas blakus vāciņa struktūrai RNS 5' galā. Enzīms izmanto S-adenozilmetionīnu (SAM) kā metildonoru, lai metilētu RNS ar vāciņu. -0), kā rezultātā tiek iegūta struktūra cap-1.

Cap1 struktūra var palielināt translācijas efektivitāti, uzlabojot mRNS ekspresiju transfekcijas un mikroinjekcijas eksperimentos. Šim fermentam kā substrāts ir īpaši nepieciešama RNS ar m7GpppN vāciņu.Tas nevar izmantot RNS ar pN, ppN, pppN vai GpppN 5' galā.RNS ar vāciņu var sagatavot, izmantojot in vitro transkripciju, izmantojot vāciņa analogu, vai ar enzīmu ierobežošanu, izmantojot Vaccinia Cappping Enzyme.

Sastāvdaļas

mRNS Cap 2´-O-metiltransferāze (50 U/μL)

10 reakcijas buferis

Uzglabāšana

-25 ～- 15 ℃ uzglabāšanai (Izvairieties no atkārtotiem sasaldēšanas-atkausēšanas cikliem)

Uzglabāšanas buferis

20 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 ℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50% glicerīna.

Vienības definīcija

Viena vienība ir definēta kā enzīma daudzums, kas nepieciešams, lai 1 stundas laikā 37°C temperatūrā metilētu 10 pmolus 80 nt ierobežotas RNS transkripta.

Kvalitātes kontroles testi

Eksonukleāze:50 U mRNS Cap 2´ -O-metiltransferāzes ar 1 μg λ-Hind III sagremotas DNS 37 ℃ temperatūrā 16 stundas nerada degradāciju, kā noteikts ar agarozes gēla elektroforēzi.

Endonukleāze: 50 U mRNS Cap 2´ -O-metiltransferāzes ar 1 μg λDNS 37 ℃ temperatūrā 16 stundas nenoārda, kā noteikts ar agarozes gēla elektroforēzi.

Nikase: 50 U mRNS Cap 2´ -O-metiltransferāzes ar 1 μg pBR322 37 ℃ temperatūrā 16 stundas nenoārda, kā noteikts ar agarozes gēla elektroforēzi.

RNāze: 50 U mRNS Cap 2´ -O-metiltransferāzes ar 1,6 μg MS2 RNS 4 stundas 37 ℃ temperatūrā nenoārda, kā noteikts ar agarozes gēla elektroforēzi.

E. coli DNS: 50 U mRNS Cap 2´-O-metiltransferāzes tiek pārbaudītas, lai noteiktuE. coli genoma DNS, izmantojot TaqMan qPCR ar primeriem, kas specifiskiE. coli 16S rRNS lokuss.TheE. coli genoma DNS piesārņojums ir =1E. coli genoms.

Baktēriju Endotoksīns: LAL tests, saskaņā ar Ķīnas Farmakopejas IV 2020. gada izdevumu, gēla limita testa metode, vispārīgs noteikums (1143).Baktēriju endotoksīnu saturam jābūt =10 EU/mg.

Reakcijas sistēma un apstākļi

1. Apvienojiet atbilstošu daudzumu RNS ar vāciņu un RNāzes nesaturošu H2O 1,5 ml mikrofūgas mēģenē līdz galīgajam tilpumam 16,0 µL.

2. Karsējiet 65 ℃ 5 minūtes, pēc tam 5 minūtes izmantojiet ledus vannu.

3. Pievienojiet tālāk norādītos komponentus norādītajā secībā (Capped RNS metilēšanai

mazāk par 10

*10 x aizbāžņa reakcijas buferšķīdums: 500 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 ℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. Inkubējiet 37 ℃ 1 stundu (mērķa fragmentam, kas mazāks par 200 nt, ir ieteicama 2 stundu inkubācija).

Lietojumprogrammas

Uzlabot mRNS ekspresiju mikroinjekcijas un transfekcijas eksperimentu laikā.

Piezīmes par lietošanu

1. Pirms reakcijas RNS ir jāattīra un jāizšķīdina ūdenī bez nukleāzes, visi šķīdumi nedrīkst saturēt EDTA un jonus.

2. Pirms reakcijas parauga RNS ieteicams karsēt 65 ℃ temperatūrā 5 minūtes, lai noņemtu sekundāro struktūru stenogrammas 5' galā.Sarežģītai 5 ' termināla struktūrai to var pagarināt līdz 10 minūtēm.