M-MLV reversā transkriptāze
RevScript Reverso transkriptāzi iegūst, izmantojot gēnu inženierijas tehnoloģiju.Tam ir augstāka cDNS sintēzes spēja, termiskā stabilitāte un reakcijas temperatūras robeža (līdz 60°C).Sintezētais cDNS produkts ir līdz 10 kb.Tas uzlabo veidņu afinitāti un ir piemērots RNS veidņu reversai transkripcijai ar sarežģītu sekundāro struktūru vai zemu kopiju gēniem.
Sastāvdaļas
| Komponents | HC2003B (10 000 U) | HC2003B (5*10 000 U) | HC2003B (200 000 U) |
| RevScript reversā transkriptāze (200 U/μL) | 50 μL | 5 × 50 μL | 1 ml |
| 5 × RevScript buferis | 250 μl | 1,25 ml | 5 ml |
Uzglabāšanas stāvoklis
Šis produkts jāuzglabā -25°C ~ -15°C temperatūrā 2 gadus.
Vienības definīcija
Viena vienība iekļauj 1 nmol dTTP skābē nešķīstošā materiālā 10 minūtēs 37 °C temperatūrā, izmantojot Oligo(dT) kā primerus.
Reakcijas iestatīšana
1.RNS veidnes denaturēšana (Šis solis nav obligāts, RNS veidnes denaturēšana palīdz atvērt sekundārās struktūras, kas uzlabos pirmās ķēdes cDNS iznākumu.)
| Sastāvdaļas | Sējums (μL) |
| Bez RNāzes ddH2O | Uz 13 |
| Oligo (dT)18 (50 μmol/L) vai Random Primer (50 μmol/L) Vai gēnu specifiskie primeri (2 μmol/L) | 1 |
| vai 1 | |
| vai 1 | |
| RNS veidne | X a |
Piezīmes:
1) a: Kopējā RNS: 1-5 ug vai mRNS: 1-500 ng
2) Inkubēšana 65°C temperatūrā 5 minūtes, pēc tam nekavējoties pārnes uz ledus, lai atdzesētu 2 minūtes.Īsa centrifugēšana, lai savāktu reakcijas šķidrumu, pievienojiet reversās transkripcijas reakcijas šķīdumu, kā parādīts nākamajā tabulā.Viegli ar pipeti samaisa.
1.Reakcijas maisījuma sagatavošana (tilpums 20 μL)
| Sastāvdaļas | Sējums (μL) |
| Iepriekšējā posma maisījums | 13 |
| 5 × buferis | 4 |
| dNTP maisījums (10 nmol/l) | 1 |
| Reversā transkriptāze (200 U/μL) | 1 |
| RNāzes inhibitors (40 V/μl) | 1 |
1.Veiciet reakciju šādos apstākļos:
| Temperatūra (°C) | Laiks |
| 25 °Ca | 5 min |
| 42 °Cb | 15-30 minūtes |
| 85 °Cc | 5 min |
Piezīmes:
1) a.Inkubēšana 25°C temperatūrā 5 minūtes ir nepieciešama tikai izlases veida heksamēru izmantošanai.Lūdzu, izlaidiet šo darbību, ja izmantojat Oligo (dT)18vai Gēnu specifiskais primer.
2) b.Ieteicamā reversās transkripcijas temperatūra ir 42°C. Veidnēm ar sarežģītām sekundārajām struktūrām vai augstu GC saturu ieteicams paaugstināt reakcijas temperatūru līdz 50-55°C.
3) c.Karsēšana 85 ° C temperatūrā 5 minūtes, lai inaktivētu reverso transkriptāzi.
4) Produktu var tieši izmantot PCR vai qPCR reakcijās vai uzglabāt -20°C īstermiņa uzglabāšanai.Produktus ieteicams izlīdzināt un uzglabāt -80°C ilgstošai uzglabāšanai.Izvairieties no biežas sasaldēšanas-atkausēšanas.
5) Produkts ir piemērots vienpakāpes RT-qPCR, ieteicams pievienot 10-20 U reversās transkriptāzes katrai 25μL reakcijas sistēmai vai pakāpeniski palielināt reversās transkriptāzes daudzumu atbilstoši faktiskajai situācijai.
Piezīmes
1.Lūdzu, saglabājiet eksperimentālo zonu tīru;Darbības laikā jāvalkā tīri cimdi un maskas.Visiem eksperimentā izmantotajiem palīgmateriāliem jābūt brīviem no RNāzes, lai novērstu RNāzes piesārņojumu.
2.Visas procedūras jāveic uz ledus, lai novērstu RNS degradāciju.
3.Lai nodrošinātu augstu reversās transkripcijas efektivitāti, ieteicams izmantot augstas kvalitātes RNS paraugus.
4.Šis produkts ir paredzēts tikai izpētei.
5.Jūsu drošībai, lūdzu, strādājiet ar laboratorijas mēteļiem un vienreizlietojamiem cimdiem.
