Divpavedienu RNS (dsRNS) ELISA KOMPLEKTS

Šis komplekts ir ar enzīmu saistītā imūnsorbcijas testa (ELISA) savienojums ar biotīna-streptavidīna sistēmu, lai kvantitatīvi noteiktu dsRNS, kuras garums pārsniedz 60 bāzes pārus (bp), neatkarīgi no secības.Plāksne ir iepriekš pārklāta ar anti-dsRNS antivielu.Paraugā esošā dsRNS tiek pievienota un saistās ar antivielām, kas pārklātas uz iedobēm.Un tad tiek pievienota biotinilēta anti-dsRNS antiviela, kas paraugā saistās ar dsRNS.Pēc mazgāšanas pievieno HRP-Streptavidīnu, kas saistās ar biotinilētu anti-dsRNS antivielu.Pēc inkubācijas nesaistītais HRP-Streptavidīns tiek nomazgāts.Pēc tam pievieno TMB substrāta šķīdumu un katalizē ar HRP, lai iegūtu zilas krāsas produktu, kas pēc skābes apturēšanas šķīduma pievienošanas kļuva dzeltenā krāsā.Dzeltenās krāsas blīvums ir proporcionāls plāksnē uztvertajam dsRNS mērķa daudzumam.Absorbciju mēra pie 450 nm.

Pieteikums

Šis komplekts ir paredzēts atlikušās dsRNS kvantitatīvai mērīšanai.

Komplekta sastāvdaļas

Uzglabāšana un stabilitāte

1. Neizmantotam komplektam: visu komplektu var uzglabāt 2 ~ 8 ℃ glabāšanas laikā.Uzglabāšanas stabilitātes nodrošināšanai ir jāizvairās no spēcīgas gaismas.

2. Izlietotajam komplektam: kad mikroplāksne ir atvērta, lūdzu, pārklājiet neizmantotās iedobes ar plākšņu aizzīmogotāju un atgriezieties folijas maisiņā, kurā ir desikantu iepakojums, noslēdziet folijas maisiņu ar rāvējslēdzēju un pēc iespējas ātrāk pēc lietošanas atgriezieties pie 2 ~ 8 ℃.Citi reaģenti pēc iespējas ātrāk jāatgriež līdz 2 ~ 8 ℃ temperatūrai.

Nepieciešamie materiāli, bet netiek piegādāti

1. Mikroplašu lasītājs ar 450±10nm filtru (labāk, ja spēj noteikt pie viļņa garuma 450 un 650 nm).

2. Mikroplašu kratītājs.

3. RNāzes nesaturoši uzgaļi un centrifūgas mēģenes.

Darbības blokshēma

Pirms tu sāc

1. Pirms lietošanas sasildiet visas komplekta sastāvdaļas un paraugus istabas temperatūrā (18-25 ℃).Ja komplekts netiks izlietots vienā reizē, lūdzu, izņemiet tikai sloksnes un reaģentus šim eksperimentam un atstājiet atlikušās sloksnes un reaģentus vajadzīgajā stāvoklī.

2. Mazgāšanas buferis: atšķaida 40 ml 20 reizes koncentrēta mazgāšanas buferšķīduma ar 760 mL dejonizēta vai destilēta ūdens, lai sagatavotu 800 mL 1 reizes mazgāšanas buferšķīduma.

3. Standarts: pirms lietošanas īsi izgrieziet vai centrifugējiet izejas šķīdumu.Četru standartu koncentrācija ir 5ng/μL.UTP un pUTP dsRNS standartiem, lūdzu, atšķaidiet izejas šķīdumu līdz 1,0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,0312, 0,0156,0 pg/μL ar STE buferšķīdumu, lai uzzīmētu standarta līkni.N1-Me-pUTP dsRNS standartiem, lūdzu, atšķaidiet izejas šķīdumu līdz 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312, 0pg/μL ar STE buferšķīdumu, lai uzzīmētu standarta līkni.5-OMe-UTP dsRNS standartam, lūdzu, atšķaidiet izejas šķīdumu līdz 4,2,1,0,5, 0,25,0,125, 0,0625, 0pg/μL ar STE buferšķīdumu, lai uzzīmētu standarta līkni.Mēs iesakām standartus atšķaidīt, izmantojot šādas diagrammas:

4. Biotinilētas noteikšanas antivielas un HRP-streptavidīna darba šķīdums: pirms lietošanas īsi izgrieziet vai centrifugējiet izejas šķīdumu.Atšķaida tos līdz darba koncentrācijai ar atšķaidīšanas buferšķīdumu.

5. TMB substate: aspirējiet nepieciešamo šķīduma devu ar sterilizētiem uzgaļiem un vairs neizlejiet atlikušo šķīdumu flakonā.TMB substrāts ir jutīgs pret gaismu, nepakļaujiet TMB substrātu gaismai ilgu laiku.

Izmantojot protokolu

1. Nosakiet testam nepieciešamo sloksņu skaitu.Ievietojiet sloksnes izmantošanai rāmjos.Atlikušās plākšņu sloksnes, kas nav izmantotas šajā pārbaudē, jāiepako maisā ar desikantu.Cieši aizveriet maisiņu uzglabāšanai ledusskapī.

2. Katram standarta, tukšā parauga un parauga atšķaidījumam pievienojiet 100 μL attiecīgajās iedobēs.Pārklājiet ar plākšņu blīvētāju.Inkubējiet 1 stundu istabas temperatūrā, kratot ar ātrumu 500 apgr./min.Precīzai analīzei paraugi jāatšķaida ar STE buferšķīdumu līdz atbilstošai koncentrācijai.

3. Mazgāšanas solis: aspirējiet šķīdumu un mazgājiet ar 250 μL mazgāšanas buferi katrā iedobē un ļaujiet tai nostāvēties 30 sekundes.Pilnībā izmetiet mazgāšanas buferi, uzspiežot plāksni uz absorbējoša papīra.Pilnībā mazgāt 4 reizes.

4. Katrā iedobē pievienojiet 100 μL biotinilētu noteikšanas antivielu darba šķīduma.Pārklājiet ar plākšņu blīvētāju.Inkubējiet 1 stundu istabas temperatūrā, kratot ar ātrumu 500 apgr./min.

5. Atkārtojiet mazgāšanas soli.

6. Katrā iedobē pievienojiet 100 μL HRP-streptavidīna darba šķīduma.Pārklājiet ar plākšņu blīvētāju.Inkubējiet 30 minūtes istabas temperatūrā, kratot ar ātrumu 500 apgr./min.

7. Atkārtojiet mazgāšanas soli vēlreiz.

8. Katrā iedobē pievienojiet 100 μL TMB substrāta šķīduma.Pārklājiet ar plākšņu blīvētāju.Inkubēt 30 minūtes istabas temperatūrā Sargāt no gaismas.Šķidrums kļūs zils, pievienojot substrāta šķīdumu.

9. Katrā iedobē pievienojiet 50 μL stop šķīduma.Šķidrums kļūs dzeltens, pievienojot stop šķīdumu.Pēc tam palaidiet mikroplašu lasītāju un nekavējoties veiciet mērījumus pie 450 nm.

Rezultātu aprēķins

1. Nosakiet katra standarta, kontroles un parauga dublikātu rādījumu vidējo vērtību un atņemiet vidējo nulles standarta optisko blīvumu.Izveidojiet standarta līkni ar absorbciju uz vertikālās (Y) ass un dsRNS koncentrāciju uz horizontālās (X) ass.

2. Aprēķinu ieteicams veikt ar datorizētu līkņu pielāgošanas programmatūru, piemēram, curve expert 1.3 vai ELISA Calc 5 vai 4 parametru nelineārās atbilstības modelī.

Performance

1. Jūtība:

apakšējā noteikšanas robeža: ≤ 0,001 pg/μL (UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNS), ≤ 0,01 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNS).

kvantitatīvās noteikšanas apakšējā robeža: 0,0156 pg/μL (UTP-, pUTP-dsRNS), 0,0312 pg/μL (N1-Me-pUTP-dsRNS), 0,0625 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNS).

2. Precizitāte: Intra-Assay CV ≤10%, Inter-Assay CV ≤10%

3. Atgūšana: 80% ~ 120%

4. Linearitāte: 0,0156–0,5 pg/μL (UTP-, pUTP-dsRNS) 0,0312–1 pg/μL (N1-Me-pUTP dsRNS), 0,0625–1 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNS).

Apsvērumi

1. TMB reakcijas temperatūra un laiks ir kritisks, lūdzu, kontrolējiet tos stingri saskaņā ar instrukcijām.

2. Lai panāktu labu testa reproducējamību un jutību, ir ļoti svarīgi pareizi nomazgāt plāksnes, lai noņemtu nereaģējušo reaģentu pārpalikumu.

3. Pirms lietošanas visi reaģenti rūpīgi jāsamaisa un jāizvairās no burbuļu veidošanās parauga vai reaģentu pievienošanas laikā.

4. Ja koncentrētā mazgāšanas buferšķīdumā (20x) ir izveidojušies kristāli, sasildiet līdz 37℃ un viegli samaisiet, līdz kristāli ir pilnībā izšķīduši.

5. Nepārbaudiet paraugus, kas satur nātrija azīdu (NaN3), jo tas var iznīcināt HRP aktivitāti, kā rezultātā dsRNS daudzums tiek novērtēts par zemu.

6. Pārbaudes laikā izvairieties no RNāzes piesārņojuma.

7. Standartu/paraugu, noteikšanas antivielu un SA-HRP var veikt arī RT bez kratīšanas, taču tas var izraisīt noteikšanas jutības samazināšanos vienu reizi.Šajā gadījumā mēs iesakām UTP un pUTP dsRNS standartus atšķaidīt no 2pg/μL, N1-Me-pUTP dsRNS standartus atšķaidīt no 4pg/μL un 5-OMe-UTP dsRNS standartus atšķaidīt no 8pg/μL.Turklāt inkubējiet HRP-streptavidīna darba šķīdumu 60 minūtes istabas temperatūrā.Neizmantojiet kolbu kratītāju, jo kolbu kratītājs var radīt neprecīzu rezultātu.

Tipisks rezultāts

1. Standarta līknes dati

2. Standarta līknes aprēķins

3. Ieliktņa noteikšanas diapazons:0,0312-1pg/μL